隔药饼灸对环磷酰胺诱导免疫抑制兔共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28的影响

支博远，毛凯荣，田岳凤，翟春涛，李玮

山西中医药大学第二临床学院，山西 晋中 030619

艾灸疗法是中医的特色治疗方法之一，主要利用艾绒燃烧刺激人体穴位或特定部位，通过激发经气活动来调整机体紊乱的生理生化功能，从而达到防治疾病的目的［1］。隔药饼灸是隔物灸法现代临床应用的重要形式，在艾条灸较柔和且持久的温热效应基础上，配合药物复方制饼作为衬隔物，不仅使艾灸治疗的优势病种涵盖范畴得以拓展，而且在免疫功能调节方面表现出更突出的作用［2-3］。艾灸疗法可对循环、神经、内分泌系统以及艾灸局部分子靶点激活产生影响，凭借神经-内分泌-免疫调节网络，实现对机体免疫功能的广泛调节，其中对特异性免疫功能激活是维持机体免疫稳态的重要途径［4］。T淋巴细胞是特异性免疫中细胞免疫的重要效应细胞，其激活和功能依赖“第二信号”即共刺激信号参与。针对T 淋巴细胞活化促进和抑制的不同作用，共刺激信号分子调控功能表现出正负两种作用形式。细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）、CD28 和4-1BB 均为T 淋巴细胞上的共刺激分子，其中CTLA-4 表现出负向调控作用，而CD28、4-1BB 则表现出正向调控作用。本课题组前期研究发现，隔药饼灸可更好地通过调控负性共刺激分子程序性死亡受体1（PD-1）表达，提高机体的免疫功能［5］。由于共刺激分子数量众多且在作用时重叠但不冗余，这一特性提示隔药饼灸在改善免疫功能时可能还有其他共刺激信号分子的参与。因此，本研究探讨了隔药饼灸对环磷酰胺诱导免疫抑制兔共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28的影响，旨在为进一步探索隔药饼灸改善免疫功能的作用机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 大耳白兔32 只，雌雄各半，体质量（2.5 ± 0.3）kg，购自北京市昌扬西山养殖场［动物许可证号：SCXK（京）2016-0007］。所有大耳白兔饲养于山西中医药大学实验动物中心，分笼饲养，定量饮食、足量饮水。饲养环境：温度18～25 ℃、相对湿度50%～70%。本研究严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》，动物伦理编号：2021DW036。艾绒，购自北京同仁堂中药饮片有限责任公司；注射用环磷酰胺，购自江苏盛迪医药有限公司；遵六味地黄汤原方剂量饮片，购自山西同仁堂大药房，熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮、茯苓按8∶4∶4∶3∶3∶3组配，研磨成粉，过120目筛备用。兔解剖台，购自张家港市青松生物医学仪器有限公司；DG5033A 型全自动酶标仪，购自烟台华东电子科技有限公司；H550L型倒置显微镜，购自日本尼康株式会社。CTLA-4、4-1BB、CD28 ELISA 试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；抗CTLA-4 单克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司；抗4-1BB单克隆抗体及HRP标记的IgG二抗，购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 动物分组干预 大耳白兔适应性喂养7 天，随机分为空白组、模型组、艾条灸组、隔药饼灸组，每组8 只。模型组、艾条灸组和隔药饼灸组每日9：00—11：00腹腔注射生理盐水稀释的环磷酰胺60 mg/kg，连续注射7 天，制备免疫抑制模型。以动物出现精神状态差、饮食少、有脱毛现象即为模型制备成功［3］。空白组同期腹腔注射等量生理盐水。模型制备成功次日，将艾条灸组和隔药饼灸组固定于兔解剖台，参照《实验针灸学》［6］常用动物穴位定位法和拟人比照法［4］，选取神阙穴、关元穴、足三里穴（双侧）、脾俞穴（双侧）、肾俞穴（双侧）备皮。隔药饼灸组：六味地黄汤药粉温水调匀，用模具制成直径10 mm、厚3 mm 的药饼，置于上述穴位处；将艾绒用艾柱模具制成艾柱（质量约0.3 g，直径0.8 cm、高0.5 cm），置于药饼之上，线香点燃，燃尽易壮，每穴连灸五壮，隔日1次，共10 次。艾条灸组：将与隔药饼灸组5壮艾柱等量艾绒（质量约1.5 g）用卷烟器制成小艾条并固定于自制艾灸架上，在距离穴位2～3 cm 处施灸，隔日1 次，共10 次。空白组和模型组仅固定于兔解剖台相同时间，不予艾灸。

1.3 血清CTLA-4、4-1BB、CD28 检测 艾条灸组和隔药饼灸组末次干预次日，空白组和模型组同时间，20%乌拉坦5 mL/kg 耳缘静脉注射麻醉。麻醉完全后，仰卧位固定于兔解剖台，抽取腹腔静脉血5 mL，室温静置10 min，3 000 r/min 离心10 min、离心半径8.5 cm，留取上层血清，-20 ℃冰箱保存。采用ELISA法检测血清CTLA-4、4-1BB、CD28。所有操作严格按试剂盒说明进行。

1.4 脾脏和肝脏组织CTLA-4、4-1BB表达检测 腹腔静脉取血后，耳缘静脉注射空气处死，无菌条件下迅速摘取脾脏和肝脏，10%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、包埋，5 µm 厚连续切片。切片经烤片干燥后，常规脱蜡至水，然后置于EDTA 抗原修复液中，微波炉内加热抗原修复。自然冷却至室温，山羊血清封闭30 min，分别滴加抗CTLA-4、4-1BB 单克隆抗体（稀释比均为1∶200），4 ℃孵育过夜。次日，滴加HRP 标记的IgG 二抗（稀释比1∶1 000），37 ℃孵育45 min。DAB 显色，苏木素复染，盐酸乙醇分化，常规脱水、透明、封固，显微镜下拍照。

由两位经验丰富的病理科医师独立阅片。结果不一致时，协商解决。CTLA-4、4-1BB阳性染色定位于细胞质、细胞膜或细胞间质，呈棕褐色颗粒。每张切片随机选择5个200倍镜下视野，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件检测每视野平均光密度，以其平均值作为脾脏或肝脏组织CTLA-4、4-1BB阳性表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。计量资料服从正态分布且方差齐性，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清CTLA-4、4-1BB、CD28 水平比较 见表1。

表1 各组血清CTLA-4、4-1BB、CD28水平比较（pg/mL，±s）

表1 各组血清CTLA-4、4-1BB、CD28水平比较（pg/mL，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与艾条灸组比较，△P＜0.05。

组别空白组模型组艾条灸组隔药饼灸组CD28 4.39 ± 1.56 8.60 ± 0.92*6.30 ± 1.24*#5.14 ± 1.17*#△21.82＜0.05 n8 8 8 8 F P CTLA-4 75.76 ± 2.29 103.82 ± 3.96*92.76 ± 2.83*#89.90 ± 2.39*#△154.04＜0.05 4-1BB 190.53 ± 21.39 124.39 ± 30.00*137.37 ± 28.80*#152.65 ± 28.39*#△11.13＜0.05

2.2 各组脾脏和肝脏组织CTLA-4、4-1BB 表达比较 见表2。

表2 各组脾脏和肝脏组织CTLA-4、4-1BB阳性表达比较（±s）

表2 各组脾脏和肝脏组织CTLA-4、4-1BB阳性表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别空白组模型组艾条灸组隔药饼灸组n8 8 8 8 CTLA-4阳性表达脾脏组织0.177 2 ± 0.039 0 0.237 7 ± 0.041 1*0.194 1 ± 0.050 5#0.187 0 ± 0.026 2#4.422＜0.05肝脏组织0.179 9 ± 0.030 9 0.227 1 ± 0.032 4*0.190 3 ± 0.041 0#0.183 6 ± 0.032 6#3.960＜0.05 F P 4-1BB阳性表达脾脏组织0.268 5 ± 0.029 6 0.219 7 ± 0.029 0*0.245 1 ± 0.037 7 0.256 0 ± 0.039 5#2.680＜0.05肝脏组织0.289 3 ± 0.060 4 0.220 4 ± 0.051 9*0.266 0 ± 0.028 7#0.280 4 ± 0.027 6#4.736＜0.05

3 讨论

免疫功能及微生态平衡在内的一切抗病物质与能力，即机体抵御外邪入侵的能力，在中医上称之为“正气”。正气充盈可抵御外邪入侵，还可驱邪外出，这与免疫系统的功能相近。正气调和阴阳，促使阴平阳秘，从而恢复阴阳相对平衡的状态，相当于免疫稳态。无论从传统中医理论着眼，还是从现代免疫体系出发，二者的作用基础均归结于机体的整体调节，而达到机体自身的稳定与平衡是防病和治病的基础。这表明中医“正气”与西医“免疫”两种理论有着共同的落脚点。

《医学入门》云：“凡病药之不及，针之不到，必须灸之。”艾灸可通过调节机体免疫而发挥温通、活血、扶正祛邪等功效。艾灸疗法主要分为艾条灸、直接灸和间接灸三种，隔药饼灸是间接灸中最常见的一种，不仅可发挥艾灸和穴位的作用，还可联合所选药物制作的隔药饼与艾灸共同发挥协同作用。前期研究表明，隔药饼灸能够有效改善免疫抑制兔的免疫功能［3］。在此基础上，以隔六味地黄汤药饼灸为主要研究方向，进一步研究隔药饼灸干预免疫抑制兔的作用机制。

共刺激信号最早在针对解释B淋巴细胞耐受性诱导的双信号模型中提出，在该模型基础上扩展研究并应用于T 淋巴细胞激活机制［7］，被后来研究者称为经典“双信号”。针对T淋巴细胞活化促进和抑制的不同作用，共刺激信号分子调控功能表现出正负两种作用形式。关于共刺激信号发挥作用的一个模型借鉴潮汐变化解释共刺激信号在响应表达时会受到机体内部环境变化的影响，从而平衡宿主先天细胞和微生物之间的通信，使正负免疫效应趋于平衡，即共刺激信号调节是由两种相反效应分子作用的最终结果决定［8］。这种动态的作用方式与中医理论中的“正邪”“阴阳”似乎有异曲同工之处。

共刺激信号分子多是在T 淋巴细胞膜上构成性表达，且大多数共刺激信号是在激活的T 淋巴细胞上表达，尤其是共抑制分子信号。共刺激信号分子CD28 在幼稚T 淋巴细胞上不断表达，与其配体B7结合，传导T淋巴细胞激活所必需的共刺激信号，是已知TCR 信号存在下幼稚T 淋巴细胞激活的启动子［9］。CTLA-4与PD-1同属于CD28超家族共刺激分子，其中CTLA-4 与CD28 竞争性结合相同的受体B7，在防止免疫过度表达方面发挥重要作用，主要存在于细胞内库中，在抗原刺激下快速运输到细胞表面并发挥免疫调节功能［10］。在正常T淋巴细胞中，因无诱导性刺激，CTLA-4呈低表达，注射环磷酰胺后，机体免疫功能受损，T淋巴细胞增多，同时CTLA-4含量也显著增多。本研究结果显示，艾灸可降低免疫抑制兔肝脏和脾脏组织CTLA-4表达，从而提高免疫功能，且隔药饼灸的作用效果更加显著。4-1BB 是活化T 淋巴细胞表达的重要表面标志物，属于膜表面糖蛋白，与其配体4-1BBL 诱导的信号应答发生在CD28 介导的活化信号之后，不仅与T 淋巴细胞活化关系密切，而且能促进细胞增殖和阻止细胞活化诱导的细胞死亡［11］。而CTLA-4 在T 淋巴细胞激活状态下表达上调的同时，CD28会通过内吞作用表达下调。有研究表明，在CD28 与B7 结合被阻断的情况下，T 淋巴细胞会进入反应迟钝的“克隆无反应”状态，可能会影响后续共刺激信号传递［12-13］。这可能与免疫抑制兔肝脏和脾脏组织4-1BB 表达降低有关，经隔药饼灸治疗后，4-1BB 表达升高，免疫抑制兔机体的免疫功能得到改善。此外，共刺激信号分子还以可溶形式存在于外周血中，且具备与相对应的抗体结合而发挥免疫调节功能，对自身免疫疾病、肿瘤的诊断和预后评估均有重要意义［14-15］。

血清中可溶性CTLA-4 的产生主要依赖非激活状态T 淋巴细胞中编码CTLA-4 的mRNA，此时凭借其与CD28 在竞争配体的天然优势，阻断共刺激分子CD28与其配体的结合，负性调控T淋巴细胞活化和增殖；T 淋巴细胞活化后，可溶性CTLA-4 通过旁分泌形式调节机体的免疫反应，同时对CD28-B7 和CTLA-4-B7 发挥阻断作用，减弱T 淋巴细胞反应的下调作用［16］。在对不止一种恶性肿瘤的临床观察中发现，免疫功能伴随病程发展呈现下降趋势，外周血中可溶性CTLA-4含量会出现不同程度升高；而且与健康人群相比，肿瘤康复人群外周血中可溶性CTLA-4 含量依然偏高［17］。这与注射环磷酰胺构建免疫抑制模型后机体血清中可溶性CTLA-4 含量变化一致，经隔药饼灸干预后血清中可溶性CTLA-4含量降低。可溶性CD28 来源与T 淋巴细胞活化后CTLA-4发挥作用而导致膜CD28的脱落有关。临床研究发现，膜CD28 的脱落是机体免疫功能下降的重要原因，在免疫相关性疾病中外周血可溶性CTLA-4和可溶性CD28含量变化呈正相关［18］。故本研究选择可溶性CTLA-4和CD28来观察免疫抑制兔的免疫功能变化，从多角度探讨隔药饼灸在调控共刺激分子表达改善免疫功能的作用机制。本研究结果表明，免疫抑制状态下血清中可溶性CTLA-4 和CD28 升高，艾条灸组血清CTLA-4 和CD28 含量降低，隔药饼灸组降低更明显，表明隔药饼灸的作用效果更显著。可溶性4-1BB 是膜结合4-1BB 的剪接变体，通过与膜结合4-1BB 竞争4-1BBL 配体阻断细胞间的相互作用，从而防止T淋巴细胞共刺激过度，实现免疫平衡，其主要由高水平表达膜4-1BB 的活化抗原特异性CD8+T 淋巴细胞产生，但相同数量表达高水平膜4-1BB 的CD4+T 淋巴细胞产生量更多［19］。隔药饼灸可使环磷酰胺免疫抑制兔血清中升高的CD8+T淋巴细胞含量和降低的CD4+T淋巴细胞含量向正常水平转变。临床研究发现，系统性红斑狼疮患者外周血中可溶性4-1BB 与CD28 含量变化呈正相关［14，20］。有研究发现，一定量的环磷酰胺联合激动性4-1BB 抗体能够产生很好的协同作用，环磷酰胺对机体内免疫细胞产生的免疫抑制性网络可在一定程度上激发4-1BB 表达［21］。本研究结果发现，免疫抑制兔血清中可溶性4-1BB 与CD28 含量变化呈现相反趋势，这可能与环磷酰胺构建的免疫抑制模型是通过多种途径实现免疫抑制有关。

综上所述，隔药饼灸能够通过调节共刺激分子CTLA-4、4-1BB、CD28 而改善环磷酰胺诱导免疫抑制兔的免疫功能，其效果优于艾条灸。隔药饼灸在免疫调节方面的作用是通过多靶点、多通道协同完成的，但在免疫调节过程中是否还有其他共刺激分子参与，仍需进一步研究。