蛹虫草茯茶的加工工艺及其代谢产物特征分析

夏 飞, 曹时玲, 邬培鸿, 高悦华, 成 欣

(陕西科技大学 食品科学与工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

茯茶是一种后发酵茶,可以补充人体维生素、矿物质等营养成分,具有减肥、助消化、降脂、调节肠道菌群[1,2]等多种功能,被茶学界认定为21世纪健康饮料.在Eurotium cristatum(冠突散囊菌,俗称“金花菌”)作用下,黑毛茶中大分子物质转化为小分子物质,形成茯茶特有醇厚滋味.因此冠突散囊菌的数量往往是判断茯茶品质的关键指标之一.自古以来,茯茶深受奶肉食品为主的西北、边疆乃至中亚各民族喜爱.近年来,人们对自身健康关注度不断提高,茯茶因其健康功效受到了广大消费者的青睐.目前,传统的茯茶种类相对单一,茯茶的加工工艺主要以经验为主,不利于茯茶产品多元化以及茯茶产业快速发展,亟待开发新的茯茶品类.现阶段,茯茶新品类的开发主要是将黑毛茶与其他药食同源物质复配[3,4]或采用传统茯茶加工工艺对其他药食同源的植物资源加工[5,6]等方面.

蛹虫草是一种与冬虫夏草同属的食药用真菌,主产于云南、吉林、河北、内蒙古等地区[7,8],具有调节免疫[9]、抗肿瘤[10]、抗菌、抗炎[11]及抗氧化[12]等多种功效.蛹虫草中核苷类化合物、虫草酸及多种氨基酸等[11,13]是其发挥药用功能的物质基础.蛹虫草与黑毛茶复配,有望得到兼具免疫调节和降血脂、降血糖的复合功能性蛹虫草茯茶,以丰富茯茶的功能,提升茯茶的饮用价值.然而,已有研究证实,茯茶加工过程中,原料的配比及加工关键步骤会影响茯茶的品质及其代谢产物组成特征[14-16].而关于蛹虫草茯茶制作工艺的研究鲜少报道,其加工关键工艺步骤仍需进一步研究.与传统茯茶相比,蛹虫草茯茶中特有的代谢产物,具有哪些特征还尚待阐明.通常,茯茶的品质主要通过冠突散囊菌的数量以及代谢物来表征.茯茶加工过程中,汽蒸环节往往是影响茯茶中微生物的关键因素,物料配比决定了茯茶中物质的组成及含量.

为明确影响蛹虫草茯茶品质的关键加工工艺及其代谢产物特征,本研究针对原料配比和加工过程中汽蒸时间对蛹虫草茯茶品质的影响展开关键工艺步骤的探索实验.同时,利用液相色谱-质谱联用法(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)对蛹虫草茯茶中代谢产物特征进行解析,揭示蛹虫草茯茶特有的代谢产物种类组成.本研究进一步促进茯茶产品的多元化,并为深入开发蛹虫草茯茶的功能提供理论物质基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售三四级黑毛茶,蛹虫草(产地吉林).

主要试剂:甲醇、乙腈、异丙醇和甲酸均为色谱纯.碳酸钠、福林酚试剂、浓硫酸、苯酚、考马斯亮蓝G-250、蛋白胨、葡萄糖、琼脂等均为分析纯.

1.2 主要仪器及设备

LRH-400-GS智能型人工气候培养箱(广东省医疗器械厂);SP-756PC紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);Wonbio-96c多样品冷冻研磨仪(上海万柏生物科技有限公司);JXDC-20氮气吹扫仪(海净信实业发展有限公司);Vanquish Horizon system UHPLC液相色谱系统(美国赛默飞世尔科技公司);ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(美国沃特世公司);Q-Exactive HF-X质谱仪(美国赛默飞世尔科技公司).

1.3 实验方法

1.3.1 汽蒸时间对蛹虫草茯茶的影响

称取质量分数为6%的蛹虫草及黑毛茶共500 g,蛹虫草切成茶叶大小,混合均匀.用高压灭菌锅分别汽蒸5 min、10 min、15 min、20 min、25 min,汽蒸温度为100 ℃,汽蒸后渥堆4小时.渥堆结束后,用蒸锅汽蒸20 s,之后筑茶砖、标记,放入人工气候培养箱内.茶砖间距5 cm,设定温度为28 ℃,湿度78%,发花14天后取出备用.

1.3.2 原料配比对蛹虫草茯茶的影响

将蛹虫草分别按质量分数0%(FT)、2%(C-1)、4%(C-2)、6%(C-3)以及8%(C-4)与黑毛茶复配至500 g,按照1.3.1所述制备成品茶砖.

1.3.3 蛹虫草茯茶内含成分含量测定

蛹虫草茯茶样品中冠突散囊菌数量测定参考前人工作中所使用的方法[17].茶多酚含量测定参考《GB/T 8313-2008茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》.茶多糖含量采用苯酚-硫酸法测定[18].蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定[19].茶叶中干物质含量测定参考《GB/T 8303-2013 茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》.

1.3.4 蛹虫草茯茶感官评审

参照GB/T 23776-2018《茶叶感官审评方法》对蛹虫草茯茶进行感官评审.

1.3.5 蛹虫草茯茶代谢物特征分析

精确称取50 ± 5 mg蛹虫草茯茶样品(CFT)和茯茶样品(FT)至2 mL离心管中,加入一颗直径6 mm的研磨珠.向离心管中加入400 μL 80%甲醇水,使用研磨仪研磨6 min(-10 ℃,50 Hz),低温超声提取30 min(5 ℃,40 KHz).将样品于-20 ℃静置30 min.在4 ℃下13 000 rpm离心15 min,移取上清液待测.

LC-MS检测分析色谱条件:色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.,1.8 μm,Waters,Milford,USA);流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸),流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸).进样量为3 μL,柱温为40 ℃.质谱条件:样品经电喷雾电离,分别采用正、负离子扫描模式采集质谱信号.喷雾电压(正模式)为3.5 kV,喷雾电压(负模式)为-3.5 kV,S-Lens电压为50 kV,鞘气50 arb,辅助气13 arb,加热温度为425 ℃,毛细管温度为325 ℃,质谱全扫模式下,仪器分辨率设置为60 000,扫描范围为70～1 050 m/z.

1.4 数据处理

将代谢组原始数据导入代谢组学处理软件ProgenesisQI(Waters Corporation,Milford,USA)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐等操作,最终得到含保留时间、质荷比和峰强度等信息的数据矩阵.之后进行特征峰搜库鉴定,将MS和MS/MS质谱信息与代谢数据库(http://www.hmdb.ca/)进行匹配,MS质量误差设置为小于10 ppm,同时根据二级质谱匹配得分鉴定代谢物.对鉴定后的矩阵文件进行过滤、补值、归一化、对数转化等数据预处理过程.

根据代谢物在不同样本间的表达情况,对预处理后的矩阵文件进行PCA主成分分析.进而采用t检验、OPLS-DA分析及倍数变化值(fold change)筛选差异代谢物(VIP>2,p<0.05).之后根据OPLS-DA模型,选择VIP值前30的代谢物作为主要差异代谢物,以完全连锁的方法对这30种关键差异代谢物进行聚类,并对其含量值进行欧式距离矩阵(Euclidean distance matrix)计算,绘制聚类热图.最后,通过KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)注释差异代谢物参与的主要通路.

数据以“mean ± sd”表示.数据采用Microsoft Excel 2010和SPSS 20.0软件的Ducan′s多重比较法进行差异性分析,并采用Origin 2022绘图.

2 结果与讨论

2.1 蛹虫草茯茶制备关键工艺

2.1.1 汽蒸时间对冠突散囊菌数量的影响

影响茯茶品质形成的主要因素包括湿热作用和微生物发酵作用,而汽蒸会影响茶叶原料中微生物的生存率.因此本研究首先关注汽蒸时间对蛹虫草茯茶中冠突散囊菌数量的影响.汽蒸处理10 min的蛹虫草茯茶样品中,冠突散囊菌的数量达到1.4×105CFU/g,显著高于其他汽蒸时间组.汽蒸处理5 min的蛹虫草茯茶样品中冠突散囊菌数量为1.2×105CFU/g.而当汽蒸时间为15 min时,冠突散囊菌数量最低,仅为6.7×104CFU/g.当汽蒸时间为20 min及25 min时,茯砖茶中冠突散囊菌数量明显下降,这可能是由于汽蒸时间过长,增大了茶胚含水量[20],导致茯茶其他霉菌的快速生长.根据以上结果,最终选择蛹虫草茯茶的最佳汽蒸时间为10 min.

2.1.2 原料配比对蛹虫草茯茶的影响

将蛹虫草与黑毛茶按不同比例混合拼配后,汽蒸10 min制备蛹虫草茯茶,以确定原料配比对蛹虫草茯茶品质的影响.蛹虫草质量分数为2%(C-1)和4%(C-2)时,蛹虫草茯茶中茶多酚含量略有增加,然而并不具有显著性.而6%(C-3)和8%(C-4)的蛹虫草配比显著降低了蛹虫草茯茶中茶多酚的含量(p<0.05),尤其是C-4组中茶多酚含量最少,为47.84 ± 2.33 mg/g,显著低于FT组(如图1所示).表明蛹虫草的添加能够降低茶多酚含量,有利于改善茯茶的苦涩味.茶多糖的含量随着蛹虫草添加量的增多而逐渐增加,其中,C-4组的茶多糖含量最高,达到174.11 ± 2.70 mg/g(如图1所示).然而,C-4组的茶多糖含量仍显著低于FT组,表明在茯茶中添加蛹虫草会降低茶多糖的含量,这可能是由于成品茶中蛋白质类物质含量的显著增加.随着蛹虫草比例的增加,蛹虫草茯茶中蛋白质的含量显著增高.C-4组蛹虫草茯茶的蛋白质含量达到233.89 ± 4.30 mg/g,较FT组增加了70.83 mg(如图1所示).蛋白质类物质能够提高茯茶的鲜爽程度,表明蛹虫草的添加可以提升成品茶的鲜爽口感[5,6].成品茶中干物质含量在C-1组中最高,为87.49 ± 0.06%,然而与C-2、C-3组中干物质含量相比并没有显著性差异(如图1所示).

图1 不同原料配比的蛹虫草茯茶内含成分含量

2.1.3 感官评审

不同原料配比的蛹虫草茯茶感官评审结果表明,随着蛹虫草添加量的增多,蛹虫草茯茶的虫草香逐渐浓郁,而汤色也会逐渐变成橙红色,口感更醇和,且回感甘甜无涩味.其中以C-3组及C-4组色香味俱全,香气浓、汤色红、滋味佳(如图2及表1所示).综合不同原料配比蛹虫草茯茶关键内含物含量情况及感官评审结果,确定8%(C-4)的蛹虫草比例为最佳的蛹虫草茯茶配比.

表1 蛹虫草茯茶的感官评审结果

图2 蛹虫草茯茶的茶汤评审

2.2 蛹虫草茯茶(CFT)与茯茶(FT)的代谢物差异

2.2.1 主成分分析(PCA)

由PCA分析结果可知,正离子模式下,主成分1和主成分2的贡献和为59.28%(如图3(a)所示).负离子模式下,主成分1和主成分2的贡献和为62.73%(如图3(b)所示),该分析结果能较好的说明蛹虫草茯茶代谢物组成特征.

图3 CFT和FT组各样本的PCA分析图

PCA可以从总体上反应各组样本之间的总体差异和组内样本之间的变异度大小[21].蛹虫草茯茶与茯茶样本在正、负离子模式下均表现出明显的分离趋势,蛹虫草茯茶的代谢产物与茯茶的代谢产物差异较大[22],因此相较于传统茯茶,蛹虫草茯茶的代谢产物具有一定的独特特征.

2.2.2 蛹虫草茯茶代谢产物组成分析

利用差异火山图分析蛹虫草茯茶与茯茶的差异性标志代谢物,使用VIP>2.0,p<0.05为筛选标准.红色点表示显著上调的代谢物,蓝色点表示显著下调的代谢物,灰色点代表变化不显著的代谢物.与茯茶相比,蛹虫草茯茶有119种代谢物显著发生变化,其中72种代谢产物相对含量显著增加,47种代谢产物相对含量显著下降(如图4所示).

图4 CFT与FT组间差异代谢物火山图

通过文献调研,蛹虫草茯茶的差异代谢物主要可分为氨基酸及其衍生物、脂质、生物碱、黄酮类、香豆素类、多酚、糖醇类、萜类等[21,23-25](如表2所示).其中,氨基酸及其衍生物是数量最多的差异代谢物,占总数19.33%.而核苷、核苷酸及其类似物、生物碱及其衍生物、香豆素类、萜类以及黄酮类化合物数量极少,占比均不足5%.除核苷酸类、香豆素类、萜类及黄酮类,蛹虫草茯茶中其他类代谢产物均以上调为主,其中,氨基酸类代谢物上调数量明显高于下调数量.因此,蛹虫草茯茶中氨基酸类物质含量高于传统茯茶.

表2 CFT与FT的差异代谢物种类及变化情况

2.2.3 蛹虫草茯茶与茯茶主要差异代谢成分分析

依据VIP>2,选取蛹虫草茯茶和茯茶之间差异代谢产物的前30种进行分析.与茯茶相比,蛹虫草茯茶中有22种代谢物含量显著增加(p<0.05),同时有8种代谢物显著降低(p<0.05)(如图5所示).共有14种代谢产物在蛹虫草茯茶和茯茶之间差异非常明显(VIP>4.0,p<0.05),其中显著上调的代谢物包括Bursopoietin(法氏囊生成素,VIP=6.35),Azaleatin 3-arabinoside(杜鹃素3-阿拉伯糖苷,VIP=6.10),Toremifene(托瑞米芬,VIP=4.88),Deoxycholic acid(脱氧胆酸,VIP=4.54),1-Aminoglucose(1-氨基葡萄糖,VIP=4.46),Guanidino arginine(胍基精氨酸,VIP=4.43),Curcumenol(姜黄素醇,VIP=4.30),Quinolinic Acid(喹啉酸,VIP=4.16)及Gln Tyr Leu(谷氨酰胺、络氨酸、亮氨酸,VIP=4.12)等.这些代谢物可能是蛹虫草茯茶的主要特征代谢物.

图5 CFT与CT组间主要差异代谢物相关性分析(VIP柱状图表示代谢产物在CFT和FT之间的差异.“＊”表示p<0.05;“＊＊”表示p<0.01;“＊＊＊”表示p<0.001)

2.2.4 蛹虫草茯茶及茯茶间差异代谢物代谢途径

对蛹虫草茯茶中119种显著差异性代谢物(VIP>2.0,p<0.05)进行通路富集分析(如图6所示).图6中,X轴代表通路影响,Y轴代表通路富集,富集点直径代表通路的丰度,深色代表更高的通路影响值.结果发现有四种代谢途径在蛹虫草茯茶与茯茶之间显示出较高的途径影响值.其中,精氨酸和脯氨酸代谢(Arginine and proline metabolism)通路对蛹虫草茯茶中P-Coumaroylagmatine(对酰基胍基丁胺)、4-Hydroxycinnamoylagmatine(4-羟基肉桂酰丁胺)、L-4-Hydroxyglutamate semialdehyde(L-4-羟基谷氨酸半醛)、L-Phosphoarginine(L-磷酸精氨酸)及Ornithine(鸟氨酸)等物质的形成具有重要影响.氨基糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)通路对蛹虫草茯茶中UDP-N-acetyl-D-mannosamine(UDP-N-乙酰-D-甘露糖胺)、N-Glycolylneuraminic acid(N-羟乙酰神经氨酸)、D-Glucuronic acid 1-phosphate(D-葡萄糖醛酸1-磷酸)及Uridine diphosphate-N-acetylglucosamine(尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖)的代谢影响也较大.而烟酸和烟酰胺的代谢(Nicotinate and nicotinamide metabolism)及精氨酸生物合成(Arginine biosynthesis)两种代谢通路会影响蛹虫草茯茶中Quinolinic Acid(喹啉酸)、6-Hydroxynicotinic Acid(6-羟基烟酸)、N-alpha-Acetyl-L-citrulline(N-α-乙酰-L-瓜氨酸)及Ornithine(鸟氨酸)等代谢物的变化.因此,蛹虫草茯茶中的氨基酸类物质含量相较于传统茯茶有所增加,该结果与章节2.2.2一致.

图6 CFT与FT的差异代谢物代谢途径的拓扑分析

3 结论

本研究探索了影响蛹虫草茯茶品质的关键加工步骤,并对蛹虫草茯茶的代谢产物特征进行解析.黑毛茶中添加8%的蛹虫草,汽蒸10 min制得的蛹虫草茯茶具有茶多酚含量低,茶多糖、蛋白质含量高等特点.且汤色橙红透亮,口感醇和回甘.与传统茯茶相比,蛹虫草茯茶中氨基酸类物质含量明显增加.同时,脂质、生物碱、黄酮类、香豆素类、多酚、糖醇类、萜类等物质也发生明显变化.代谢通路分析证实,蛹虫草茯茶中氨基酸类物质可能是通过精氨酸和脯氨酸代谢等途径产生.本研究初步探索了蛹虫草茯茶的加工工艺关键步骤,揭示了蛹虫草茯茶的代谢产物特征,为促进茯茶产品多元化以及深入开发蛹虫草茯茶功能奠定物质理论基础.