蔬菜膳食纤维基多菌群乳酸菌生物膜的制备、表征及其稳定性分析

吕嘉枥, 杜倩茹, 杨柳青, 徐 颖

(1.陕西科技大学 食品科学与工程学院, 陕西 西安 710021; 2.陕西巨子生物技术有限公司, 陕西 西安 710065)

0 引言

益生菌膳食补充剂因其良好的健康功效和食用方便性,被越来越多的消费者接受,也备受研究者和生产者关注.益生菌是一类活的微生物,当摄入足够数量时,会对宿主产生有益作用[1,2].益生菌活性的高低是影响益生菌产品质量的重要指标.益生菌活性常常受到诸多因素影响而降低,尤其是消化液的影响[3],如Dodoo等[4]测试了三种商业益生菌对胃肠道的耐受性,结果表明三种益生菌置于模拟胃液5 min后,均减少到了106CFU/g以下,活力显著下降.只有足够数量的益生菌,方可通过宿主胃肠道输送,定植、增殖,最终发挥其益生作用[5-7].因此,在益生菌膳食补充剂的制备中应采用合适的方法,以保持益生菌的活性及数量,充分发挥其益生功能[8,9].

生物膜(Biofilm)是微生物不可逆的附着于有生命或无生命物体为载体的表面,经生长繁殖、发育、代谢,将菌体群落包裹其中而形成的细菌聚集体膜状物,是微生物有组织生长的聚集体[10-12].生物膜中的微生物对不良环境的抗性大大增强[13].膳食纤维(Dietary Fiber,DF)被称作“第七种类营养素”,也可以作为功能性食品的原料[14].关于益生菌与膳食纤维复合方面的研究有报道,其中,Rivas等[15]、He等[16]研究发现,番茄皮、葡萄茎、土豆皮、麦麸和燕麦壳等农业副产品中的膳食纤维与益生菌共培养时,不但有利于益生菌的生长,而且可以有效地保护益生菌活性,提高其在极端条件下的存活率;陈翠翠等[17,18]研究表明水不溶性膳食纤维(Insoluble Dietary Fiber,IDF)表面粗糙、疏松多孔、比表面积较大,具备吸附、固定益生菌的物理条件,可以作为较理想的生物膜富集载体.

生物膜已广泛应用于污水处理领域,其高细胞密度的特点可以用于富集微生物,因此生物膜技术已经受到食品、生物工程及医药领域的关注,在生产高菌浓、高活性、高稳定性的微生物制剂等方面具有广阔的应用前景.在乳酸菌类益生菌方面利用生物膜原理的研究有少许报道,Hu等[13,19]和Shi等[20]分别以醋酸纤维素膜、乙基纤维素膜为载体,37 ℃静态培养后得到活菌数为1011～1012CFU/g的乳酸菌生物膜,其抗性比游离菌体大大提高.陈翠翠等[17,18]以IDF为载体,通过摇床动态培养得到最高活菌数为1.22×109CFU/g的双歧杆菌生物膜,且其抗逆性增强.可见,利用生物膜原理进行乳酸菌类益生菌富集是可行的.

生物膜多细胞结构的形成是一个动态过程,包括细菌起始粘附、生物膜发展和成熟扩散等阶段.本研究利用生物膜形成原理,设计了一种乳酸菌生物膜形成的培养装置,并以8种乳酸菌为菌种,以MRS复合内含丰富水不溶性蔬菜膳食纤维的蔬菜浆液为营养液,其中的水不溶性蔬菜膳食纤维为富集乳酸菌的载体,进行连续动态培养.试验研究可为进一步研制果蔬膳食纤维与益生菌复合膳食补充剂提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料与菌株

四种蔬菜甘蓝、芹菜、黄瓜、冬瓜:购置于陕西西安华润万家超市.

嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus330G1),保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus330G2),干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei330G3),副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei330G5),植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum330G4),鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus330G7),嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus330Q1),戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus330Q5):由陕西科技大学食品科学与工程学院微生物实验室提供.

1.1.2 蔬菜浆液的制备

选取经前期试验研究筛选的对益生菌促生长作用显著,扫描电镜表征其纤维比表面积较大的甘蓝、芹菜、黄瓜和冬瓜等四种蔬菜.分别将四种蔬菜洗净、切段,热水漂烫后等质量比例混合,按料水比1∶3加水打浆,并通过100目筛,制得蔬菜浆液.其中富含水不溶性蔬菜膳食纤维和蔬菜汁.

1.1.3 主要试剂及配制

氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、戊二醛(均为分析纯),天津市科密欧化学试剂有限公司;无水乙醇(分析纯),天津市天力化学试剂有限公司;细菌基因组DNA抽提试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司;α-淀粉酶(3 700 U/g)、琼脂粉,北京奥博星生物技术有限责任公司;胃蛋白酶(3 000 U/mg)、胰酶(4 000 U/g),上海源叶生物科技有限公司.

模拟口腔消化液:氯化钾89.6 g,氰化钾20.0 g,磷酸二氢钠88.8 g,硫酸钠57.0 g,氯化钠175.3 g,碳酸氢钠84.7 g,尿素2.0 g,α-淀粉酶290 mg,尿酸15 mg,黏蛋白25 mg,加适量水溶解,定容至1 000 mL,用0.1 mol/L盐酸调节pH6.8,即得[21].

模拟胃液:16.4 mL稀盐酸中加入800 mL水和10 g胃蛋白酶,定容至1 000 mL,即得[22].

模拟肠液:6.8 g磷酸二氢钾加适量水溶解,用0.1 mol/L氢氧化钠调节pH至6.8;10 g胰酶加适量水溶解,将二者混合,定容至1 000 mL,即得[22].

1.1.4 培养基

(1)MRS肉汤:蛋白胨10.0 g,牛肉膏10.0 g,酵母浸粉5.0 g,葡萄糖20.0 g,乙酸钠2.0 g,磷酸氢二钾2.0 g,柠檬酸二胺2.0 g,硫酸镁0.5 g,硫酸锰0.2 g,吐温80 0.1 mL,蒸馏水1 000 mL.

(2)MRS琼脂培养基:在MRS肉汤中添加15.0～20 g/L的琼脂.

(3)MRS蔬菜浆液培养基:在配制MRS肉汤时,其中的1 000 mL蒸馏水以1 000 mL蔬菜浆液替代,即可制得MRS蔬菜浆液培养基.

培养基灭菌(121 ℃,15 min)后使用.

1.2 仪器与设备

101-1电热鼓风干燥箱,北京科伟永兴仪器有限公司;SYQ-DSX-280B压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2D超净工作台,苏州净化设备有限公司;PHS-3C pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;PHENOM-PRO台式扫描电镜,复纳科学仪器(上海)有限公司;2720 thermal cycler PCR仪,美国Applied Biosystems公司;5810R板式离心机,德国Eppendorf公司;Fragment Analyzer 5400全自动毛细管电泳系统,安捷伦科技(中国)有限公司;HC-3018R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;FD-1D-50冷冻干燥机,上海比朗仪器制造有限公司;SHA-C恒温震荡器,常州国华电器有限公司.

1.3 益生菌生物膜形成的装置

本试验设计的益生菌生物膜形成装置示意图如图1所示.

图1 益生菌生物膜形成装置示意图

1.4 实验方法

1.4.1 菌种活化

将8株乳酸菌(330G1、330G2、330G3、330G5、330G4、330G7、330Q1、330Q5)分别以1%的接种量接种于无菌MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h.重复上述操作,活化至二代,备用.

1.4.2 益生菌生物膜的形成

益生菌生物膜的形成在1.3所示的装置中完成,其工作原理和操作过程如下.

营养液通过蠕动泵从进液口流入发酵罐,从底部废液出口排入废液槽,实现循环流动培养,使益生菌获得充足的营养,生长繁殖并于载体上吸附成膜,同时在废液流出时游离益生菌被载体阻截,从而最大限度的浓集益生菌.培养结束后,将发酵罐内培养液排尽,打开下部锁扣,拆掉挡板,打开废液出口处的按钮,收获益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜.

MRS蔬菜浆液培养基通过进料口加入发酵罐,8种等比例混合的益生菌通过接种口以1%接种量接入发酵罐,37 ℃培养7天,每24 h更换营养液.首先在静止状态下进行预培养,使一定量的益生菌附着于蔬菜膳食纤维载体上,以便于循环流动培养时益生菌在膳食纤维上的生长繁殖以及生物膜的形成;然后开始循环流动培养.培养过程中,于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h从罐体侧面的取样口分别取培养液和膳食纤维样品,测试培养液中pH值、总酸、活菌数,蔬菜膳食纤维上富集的益生菌数,以及通过扫描电镜对蔬菜膳食纤维上菌群的分布情况进行表征,研究多菌群益生菌生物膜的形成情况.同时选择4个不同培养时间点(0天H0、1天H1、4天H4、7天H7),采用PCR扩增16S rDNA的V3-V4区基因片段,并基于Illumina NovaSeq测序分析蔬菜膳食纤维上富集益生菌的菌群变化.培养结束后,打开废液出口处的按钮,收获益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜.并进行贮存试验及模拟消化试验.

1.4.3 分析检测

(1) pH值

参考GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》中的方法测定[23].

(2)总酸

参考GB 12456-2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》中的方法测定,结果以乳酸计[24].

(3)益生菌活菌数量检测

参考GB 4789.35-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定活菌数[25].

(4)显微表征

取1.4.2中收获的益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜,用2.5%戊二醛溶液固定4 h;用磷酸缓冲溶液清洗3次;分别用30%、50%、75%、100%乙醇梯度脱水20 min;将样品置于60 ℃烘箱干燥处理;将样品置于真空镀膜装置镀金[26];于扫描电镜下进行显微表征.

(5)菌群结构分析

①DNA提取:收获的益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜总DNA的提取采用基因组提取试剂盒.

②PCR扩增:利用引物CCTAYGGGRBGCASCAG和GGACTACNNGGGTATCTAAT,对样品的16S rDNA V3-V4区基因片段进行PCR扩增.

③Illumina测序:Illumina NovaSeq高通量测序分析委托天津诺禾致源生物信息科技公司测定,项目编号:X101SC20101119-Z01.

④生物信息学统计分析:对原始数据进行过滤,得到有效数据,然后进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类和物种分类分析,得到对应的物种信息以及丰度分布情况;同时,进行α-多样性分析、物种多样性分析、菌群结构分析等,以得到样本内物种丰度、不同样本OTUs信息等.

(6)贮存稳定性

将收获的益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜置于25 ℃ 6个月,分别在五个时间点(0天、15天、1个月、3个月、6个月)取样,测定活菌数,以评价复合物的贮存稳定性.

(7)对消化液的耐受性

对模拟口腔消化液耐受性:将1.0 g样品加入9.0 mL模拟口腔消化液中,37 ℃摇床孵育,分别在0、10 min取样1 mL,采用稀释平板计数法进行活菌计数,按照式(1)计算存活率:

(1)

对模拟胃液耐受性:将口腔消化液处理过的样品加入9 mL模拟胃液中,37 ℃摇床孵育,分别在0、1 h、2 h、3 h取样1 mL,采用稀释平板计数法进行活菌计数,按照式(2)计算存活率:

(2)

对模拟肠液耐受性:将胃液处理过的样品加入9 mL的模拟肠液中,37 ℃摇床孵育,分别在0、2 h、4 h、6 h取样1 mL,采用稀释平板计数法进行活菌计数,按照式(3)计算存活率:

(3)

1.4.4 数据处理

试验数据取3次平行试验的平均值±标准差,图表绘制采用Origin 2021,两组间的显著性分析采用SPSS 23.0通过T检验进行,“＊”表示p<0.05,“＊＊”表示p<0.01.

2 结果与讨论

2.1 生物膜形成过程中培养液酸度的变化

由于益生菌生长可以产生大量有机酸,从而使培养液酸度下降.图2结果显示,0～24 h内pH值从5.68迅速下降至3.44,同时总酸从4.81 g/L上升至32.29 g/L,说明培养前期益生菌生长繁殖快、代谢旺盛,大量产酸,体系内pH迅速下降.24 h后酸度逐渐趋于平缓,pH值在3.30～3.45区间内波动,总酸在33.40～38.79 g/L区间内波动,说明菌的生长进入稳定期,需要更换培养液.

图2 生物膜形成过程中培养液pH和总酸的变化

因此,本试验设计每24 h更换培养液,使益生菌稳步生长.益生菌在MRS蔬菜浆液培养基中大量正常生长,可见蔬菜膳食纤维对益生菌正常生长没有影响.康婕等[27]研究发现以黄瓜、芹菜、冬瓜等蔬菜浆液培养保加利亚乳杆菌时,菌体生长良好.赵泓舟等[28]研究了竹笋膳食纤维对乳酸菌生长的影响,结果表明膳食纤维对其有促生长作用,可能是由于其中的单糖可以为乳酸菌的生长提供良好碳源.

2.2 生物膜形成过程中活菌数的变化

图3显示,由于培养过程中间隔流动添加营养液,营养物质较为充足、环境条件较为适宜,活菌数不断升高,但整个培养过程中培养液和蔬菜膳食纤维上富集的活菌数变化差异较大.0～24 h内活菌数均迅速增长,24～168 h内蔬菜膳食纤维上富集的活菌数不断增长,而培养液中的活菌数不断下降,说明益生菌不断被吸附固定到蔬菜膳食纤维中,形成了益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜,最终此复合生物膜的活菌浓度最高可达到2.24×1012CFU/g,表明蔬菜膳食纤维对多菌群益生菌具有很好的富集作用.根据目前资料报道,利用生物膜浓集益生菌的最高菌浓大都在1011～1012CFU/g之间[13,19,20].

图3 生物膜形成过程中培养液和蔬菜膳食纤维上活菌数的变化

2.3 生物膜形成过程中蔬菜膳食纤维载体的显微表征

本试验在生物膜形成过程中以酸度变化表征菌体对培养液营养的利用情况,以活菌数表征生物膜的活性,以扫描电镜表征生物膜形成与否.其中扫描电镜的表征结果如图4所示.培养过程中,在扫描电镜下观察蔬菜膳食纤维上益生菌的分布情况.500倍下可以观察到蔬菜膳食纤维的微观结构,其表面粗糙有褶皱,分布有孔洞、空隙,可以吸附包埋益生菌,在培养过程中,纤维结构未发生断裂等明显形变.0 h时蔬菜膳食纤维表面几乎没有观察到菌体,可能是由于培养初期菌种浓度较低.24 h时,2 000倍下蔬菜膳食纤维表面附着较多菌体,5 000倍下可以明显观察到菌体吸附在膳食纤维表面粗糙、褶皱处,且球菌占优势,杆菌、链球菌次之.96 h时,2 000倍下蔬菜膳食纤维表面及褶皱处几乎全部附着菌体,5 000倍下可以观察到菌体铺满膳食纤维表面,密度明显高于24 h,杆菌为优势菌,球菌次之.168 h时,2 000倍下菌体依然完全吸附在蔬菜膳食纤维表面,大量菌体被包埋在孔隙内,5 000倍下可以观察到菌体被吸附后在膳食纤维表面富集,形成了具有一定厚度的生物膜,外部的菌体将内部的菌体包埋起来,杆菌为优势菌.崔莉等[29]以胡萝卜为载体富集植物乳杆菌,试验中采用物理方法将植物乳杆菌富集到胡萝卜中,其中真空浸渍组的活菌数高达1.20×1010CFU/g,在扫描电镜下可以观察到,不仅胡萝卜的表面附着大量菌体,其组织内部也富集有菌体,这种富集方式可能具有包埋保护菌体活性的作用.在本试验的培养过程中可以观察到球菌和杆菌均可被富集形成生物膜,因此,蔬菜膳食纤维对多菌群益生菌具有吸附包埋能力,而且通过优势菌的变化可以发现,蔬菜膳食纤维对杆菌的吸附包埋效果可能更强.

图4 生物膜形成过程中蔬菜膳食纤维载体的扫描电镜图

2.4 生物膜形成过程中益生菌与蔬菜膳食纤维复合物中菌群结构的变化

2.4.1 样品PCR扩增产物

通过Agilent 5400全自动毛细管电泳系统分析检测PCR扩增产物是否合格,结果如图5所示.由图5可知,4个不同培养时间点(0天H0、1天H1、4天H4、7天H7)的PCR产物目的条带大小正确,分子量都在500 bp左右,说明扩增产物合格,可以进行Illumina NovaSeq测序.

图5 基因组PCR产物电泳图

2.4.2 α-多样性分析

对样本进行α-多样性分析可以反映其中的微生物丰度及多样性.对4个培养时间点在97%一致性阈值下的α-多样性分析指数进行统计分析,结果如表1所示.由表1可知,测序深度goods coverage均为1.000,可以代表各时间点细菌菌群的真实情况.物种数目OTUs随着培养时间变化先减后增,在H0时最高,H1之后递增.菌群丰度指数chao1、ACE变化趋势与OTUs一致.群落多样性指数shannon也呈先减后增趋势,在H0～H4时递减,H7时增大且仅次于H0.结果表明,蔬菜膳食纤维与多菌群益生菌共培养过程中,菌群结构存在差异,H0时微生物丰度及多样性最高,其次是H7.

表1 细菌群落结构多样性指数

2.4.3 物种多样性曲线

稀释曲线(Rarefaction Curve)和丰度等级曲线(Rank Abundance Curve)是常见的分析样本微生物多样性的方法.

Rarefaction Curve可以反映测序量是否合理,比较不同样本物种的丰度.如图6所示,4个培养时间点的Rarefaction Curve均趋于平缓,说明随着测序量的增加,新发现的物种数目(OTU)越来越少,测序数据量合理;物种数目从高到低依次为:H0、H7、H4、H1.

图6 稀释曲线

Rank Abundance Curve可以反映物种丰度和物种均匀度.如图7所示,4个培养时间点的Rank Abundance Curve在水平方向的宽度表示物种丰度,由高到低依次为:H0、H7、H4、H1;曲线的平缓程度表示物种均匀度,即H0时物种分布最均匀,其次是H7.所以H0时物种多样性指数最高,H7次之.

图7 丰度等级曲线

2.4.4 菌群结构分析

如图8所示,在科水平上,乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)在4个时间点始终为优势菌科,丰度分别为95.73%、99.68%、99.48%、99.35%,与最初接入的8种乳酸菌较为一致.表明在培养过程中,蔬菜膳食纤维始终对杆菌有较强的吸附包埋作用.

图8 科水平上的物种相对丰度柱形图

如图9所示,在属水平上,乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度先降后升,而片球菌属(Pediococcus)的丰度则先升后降.H0时二者的丰度与初始接入的比例较为一致,乳杆菌属为优势菌属.H1时片球菌属丰度增加至54.18%,成为优势菌属,乳杆菌属丰度下降,H7时优势菌属为乳杆菌属,丰度为97.63%,片球菌属丰度仅为1.72%.适宜杆菌生长的pH范围比球菌低,培养前期pH更适合球菌生长,球菌迅速成为优势菌;随着时间变化,pH降低,更适宜杆菌生长,且杆菌耐酸能力比球菌强,因此培养后期球菌丰度降低,杆菌成为优势菌[30,31].

图9 属水平上的物种相对丰度柱形图

如图10所示,在种水平上,H0时植物乳杆菌(LactobacillusPlantarum)和戊糖片球菌(PediococcusPentosaceus)丰度比较接近,分别为21.17%、19.97%.H1时戊糖片球菌丰度升高至54.18%,成为优势菌种,植物乳杆菌丰度下降.H4时植物乳杆菌成为优势菌种,戊糖片球菌丰度下降.H7时植物乳杆菌仍为优势菌种,丰度为49.05%,戊糖片球菌的丰度仅为1.72%.

图10 种水平上的物种相对丰度柱形图

通过群落结构分析可以得出,培养前期球菌为优势菌,培养后期杆菌为优势菌,蔬菜膳食纤维对球菌、杆菌均有吸附包埋作用,形成多菌群益生菌生物膜,且对杆菌的吸附包埋作用更强.

2.5 益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜的特性

将在富集益生菌的装置中培养7天后收获的益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜冻干后,进行显微表征、贮存试验及模拟消化试验,其结果如图11～13所示.从图11～12中可以看出,复合物冻干菌粉含丰富的蔬菜膳食纤维和益生菌群,膳食纤维表面和内部富集着大量益生菌,经检测,其中的益生菌活菌数可达到2.30×1013CFU/g.冻干菌粉25 ℃放置6个月,其益生菌活菌数可达到7.24×106CFU/g,稳定性较好.何菲[32]以玉米醇溶蛋白/纤维素复合物为载体,培养后形成的生物膜中的活菌数为1.41×109CFU/mL.

图11 冻干粉1 000×扫描电镜图

图12 冻干粉中益生菌的贮存稳定性

益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜对人工模拟消化液耐受性如图13所示.以存活率为指标,通过模拟人体口腔及胃肠道消化试验,研究益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜对消化液耐受性.由图13可知,随着消化时间的变化,各消化液中活菌数均不断下降.益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜置于模拟口腔消化液中10 min时,存活率为98.35%.复合物在模拟胃液消化过程中活菌数持续显著下降,3 h时活菌数维持在9.02×1012CFU/g左右,存活率为52.13%.Sarao等[33]认为,高酸性(pH约为1～3)的胃酸不利于益生菌生存.在模拟肠液中下降趋势较为缓慢,6 h时存活率为85.62%,其活菌数维持在7.41×1012CFU/g,较最初下降了1个数量级.而Shi等[20]制备的生物膜在模拟胃肠道中消化5 h后,活菌数下降了1.58 lg CFU/g.因此,益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜在模拟消化液中有较强的耐受力.

图13 益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜对消化液耐受性

3 结论

本试验以甘蓝、芹菜、黄瓜、冬瓜等4种蔬菜膳食纤维为载体,研究多菌群乳酸菌生物膜的形成,培养7天时蔬菜膳食纤维表面形成一定厚度的生物膜,活菌数达到2.24×1012CFU/g.通过Illumina NovaSeq高通量测序分析菌群变化,发现培养过程中乳杆菌属和片球菌属始终存在于膳食纤维样品中.益生菌与蔬菜膳食纤维复合生物膜通过贮存试验、模拟消化试验后,活菌数分别可达7.24×106CFU/g和7.41×1012CFU/g.

试验设计的益生菌富集装置实用可控,运行成本低,应用范围广泛,利于推广与应用.以该法制备的高菌浓益生菌活菌数高,贮存性能较稳定,且对模拟口腔消化液、胃肠液有较强的耐受性.因此,本试验为进一步研制果蔬膳食纤维与益生菌复合膳食补充剂提供重要试验依据和技术支撑.同时在将其应用于益生菌良好富集包埋材料、提高益生菌活性等方面有广阔的应用前景.