IGF2BP3通过激活PI3K/AKT/mTOR通路促进肝癌细胞增殖

舒敏,刘程豪,侯卜文,杜云峰,黎广,姜慧娇,吴向未,2*

(1 石河子大学医学院/国家卫生健康委中亚高发病防治重点实验室,新疆 石河子 832000;2 石河子大学医学院第一附属医院,新疆 石河子 832000)

原发性肝癌(Primary Liver Cancer,PLC)是世界上第六常见的癌症,也是第三常见的癌症死亡原因,肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是PLC的主要病理类型,约占75%～85%[1]。肝癌是多因素长期发展的过程,其主要危险因素包括感染(乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、流行地区的肝吸虫)、行为因素(酒精、烟草)、代谢因素(身体肥胖过度)和黄曲霉毒素[2]。而我国是乙肝大国,肝癌是我国疾病的主要负担之一。

RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)是一种固有的多效蛋白,通过RNA稳定性、定位、输出、加工、剪接、降解和翻译等过程,在转录后水平调控RNA代谢的不同方面和功能[3]。胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白3(insulin growth factor 2 mRNA binding protein 3,IGF2BP3)是IGF2BPs家族(高度保守的单链mRNA结合蛋白家族)的成员之一[4]。其对细胞生长、迁移、药物反应等肿瘤发生发展具有一定的调控能力[5];此外,IGF2BP3作为m6A阅读器,可介导其致癌靶标基因的稳定性促进肿瘤进展[6]。IGF2BP3在肝癌的临床诊断及预后也有一定参考价值[7]。PI3K/AKT/mTOR信号通路(PI3K/AKT/mTOR signaling pathway)参与各种重要的细胞功能,如生长、增殖、代谢和生存[8],且PI3K/AKT/mTOR是经典的响应胰岛素信号的通路,在肿瘤中发挥着充分的作用[9]。TREM2(Triggering receptors expressed on myeloid cells 2,髓系细胞触发受体2)作为预后不良独立预测因子,可通过PI3K/AKT轴促进前列腺癌的迁移[10];受miR-218-5p上调的PUM1(Pumilio homologous protein 1,短小杆菌同源物1)通过调节PI3K/AKT轴促进大肠肿瘤细胞增殖和肿瘤发生[11];且IGF2BP3的过表达可激活PI3K/AKT信号通路促进甲状腺癌的增殖、侵袭和转化[12];但IGF2BP3在肝癌中的作用与PI3K/AKT信号通路的关系尚未明确,尚待进一步研究。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

IGF2BP3引物(F:5-ATCGAGGCGCTTTCAGGTAA-3′;R:5′-TCCCACTGTAAATGAGGCGG-3′)、β-actin引物(F:5-AACCGCGAGAAGATGACCCAG-3′;R:5′-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′)均购自上海生工生物有限公司,慢病毒HOMO IGF2BP3(NM_006547.3:382-2121 Homo sapiens insulin like growth factor 2 mRNA binding protein 3(IGF2BP3)购自上海吉玛基因有限公司),IGF2BP3抗体(Abcam),AKT、p-AKT、S6、p-S6抗体(CST),GAPDH抗体(北京中杉金桥)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

HuH-7/MHCC97H细胞培养基构成:DMEM培养基,10%胎牛血清(FBS)、1%青-链霉素定容至50 mL无菌离心管中,培养瓶中加入5 mL完全培养基置于37 ℃,5% CO2的培养箱中培养。待细胞密度达到80%左右时进行实验。

1.2.2 慢病毒转染

按1.2×105个·孔-1接种于12孔板中,用含10% FBS的DMEM完全培养基培养过夜。将20 μL慢病毒原液加入到400 μL稀释液中,轻轻混匀,并加入终浓度为5 μg·mL-1的Polybrene,移去细胞培养液后加入病毒稀释液,同时建立对照,感染48 h后换回常规培养基继续培养,于荧光倒置显微镜下观察转染效率,24 h后加用嘌呤霉素进行药筛(药物浓度为2 μg·mL-1),每隔2 d更换含有嘌呤霉素的完全培养基,7 d后成功建立稳定转染过表达肝癌细胞株。待得到稳定表达细胞株后,培养细胞的培养基中加入的嘌呤霉素浓度减半。

1.2.3 qRT-PCR

取经过转染后的细胞,用无菌PBS缓冲液冲洗3次,按照RNA提取试剂盒说明书提取对照组及IGF2BP3过表达组细胞的总RNA。以总RNA为模板,参照反转录试剂盒说明书合成cDNA链。逆转录后根据qRT-PCR试剂盒提供的反应体系加样,每组配制3个复孔,上机。PCR反应程序为:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环。分析结果以2-ΔΔCt反映各样品相对对照组样品IGF2BP3基因的相对表达水平。

1.2.4 Western Blot

将转染后的细胞置于4 ℃上裂解10 min提蛋白(RIPA+1% PMSF),通过SDS-PAGE胶电泳分离样品,电泳条件设置为恒定电压80 V工作30 min,而后转变电压为120 V继续工作1 h;转膜条件设定为恒定电流200 mA 1 h湿转。常温在5% BSA中封闭2 h。4 ℃冰箱孵育一抗(IGF2BP3抗体稀释比为1∶1 000,1∶2 000稀释AKT、p-AKT、S6、p-S6抗体,1∶1 250稀释GAPDH抗体,GAPDH为内参)过夜。次日,洗去一抗,常温孵育二抗(IGF2BP3、AKT、p-AKT、S6、p-S6为兔抗,GAPDH为鼠抗)1 h,TBST洗膜3次后曝光检测蛋白质表达。Western Blot结果均重复2次或以上,趋势相同。

1.2.5 CCK-8实验

将转染好的细胞以每孔3 000个的密度铺于96孔板后继续培养。待细胞贴壁后(设为0 h点),使用CCK-8细胞活力试剂盒检测0、24、48、72 h各组细胞的活力变化。检测时弃去培养孔原有培养基,每孔加入100 μL CCK-8/基础培养基混合液(CCK-8:基础培养基=1∶9),避免产生气泡影响检测值,37 ℃放置2 h后通过全自动酶标仪检测不同处理组在450 nm的吸光度值(OD值),对数值进行分析计算,使用绘图软件绘制细胞的生长曲线,并对对照组与不同处理组之间的统计学意义进行分析。

1.2.6 EdU实验

将转染后的细胞以1.2×105个·孔-1铺于12孔板中培养24 h,避免细胞密度过大影响细胞增殖能力,按照EdU实验说明书步骤进行工作液孵育2 h;多聚甲醛固定15 min;通透液孵育30 min;Click点击液孵育30 min;Hoechst染核孵育30 min后于荧光显微镜拍照。利用ImageJ软件对图片中EdU阳性细胞数和细胞总数进行计数,计算不同组间每个视野下EdU阳性细胞数比率,每组随机选取3个视野进行计数;对其不同组别间所获得EdU阳性细胞率使用非配对t检验进行统计分析。

1.2.7 动物实验

一级4周龄BALB/c-nu雄性裸鼠10只,质量(18.0±3.6)g,购自北京斯贝福生物技术有限公司(动物许可证号SCXK(京)2019-0010)。动物实验得到伦理委员会批准(A2023-041-01)。取对数期慢病毒转染后细胞,对照组与过表达组均以4×106个细胞/只在裸鼠右侧腋窝下注射接种,建立裸鼠异位移植瘤模型,每组5只。5 d后观察成瘤情况,并用游标卡尺测量肿瘤长径(A)及其最大垂直正交径(B),每周测量1次,共测量4次,计算肿瘤大小并绘制肿瘤生长曲线,肿瘤体积=B×A2/2。

1.2.8 免疫组化染色

组织切片在65 ℃条件下烘干,脱蜡,脱水后用蒸馏水清洗,配制枸橼酸修复液,高压修复8 min,滴加3% H2O2溶液阻断过氧化物酶与抗体结合,室温避光孵育10 min,PBS清洗,IGF2BP3/Ki67抗体覆盖组织,4 ℃孵育过夜,PBS清洗,二抗37 ℃孵育30 min,PBS清洗,DAB显色,苏木精复染,酸酒精酸化,返蓝,脱水,封片,显微镜下拍照。

1.2.9 统计方法

采用GraphPad Prism进行分析及数据统计,CCK-8的OD值、PCR结果,计量数据使用“均数±标准误”,均采用t检验比较。本实验中P<0.05表示具有统计学意义,用*表示;若P<0.01,用**表示;若P<0.001,用***表示。

2 结果

2.1 过表达IGF2BP3促进肝癌细胞的增殖

通过慢病毒转染,IGF2BP3在HuH-7、MHCC97H细胞中过表达,qRT-PCR检测IGF2BP3 mRNA在对照组和过表达组表达水平的差异,结果显示,慢病毒感染后IGF2BP3可过表达10倍左右(P<0.001,图1A)。采用CCK-8实验、EdU实验检测IGF2BP3过表达对肝癌细胞增殖的影响。CCK-8实验表明过表达IGF2BP3后HuH-7、MHCC97H的OD值明显增强(P<0.01,图1B);EdU实验提示过表达IGF2BP3后EdU阳性细胞数明显增多(P<0.01,图1C)。综上所述,IGF2BP3过表达可促进体外肝癌细胞的增殖。

A.IGF2BP3 mRNA表达水平;B.CCK-8实验检测肝癌细胞增殖能力;C.EdU实验检测其EdU阳性细胞数及量化图。差异的显著性由非配对t检验确定。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。图1 在肝癌细胞中过表达IGF2BP3后,可显著促进细胞增殖

2.2 过表达IGF2BP3可促进体内肿瘤生长

为了研究IGF2BP3在体内是否有相同的促增殖作用,本实验使用4周龄的雄性裸鼠于右侧腋下建立异位移植瘤模型,10只裸鼠均造模成功,实验过程中无一例动物死亡。两组裸鼠约于造模5天后触及小硬块,然后,我们观察肿瘤生长近30天,实时测量肿瘤体积并绘制肿瘤体积生长曲线,见图2C。造模5周后对皮下瘤进行收样,可观察到IGF2BP3过表达组的肿瘤体积、重量明显大于对照组(图2A,图2B)。对皮下瘤组织(对照及过表达组均为5例)进行HE及免疫组化染色观察其成瘤情况及IGF2BP3、Ki67的表达,对照组和过表达组HE染色均可见肿瘤组织,免疫组化结果提示过表达组中IGF2BP3的表达水平较对照组明显增强,应为代表增殖能力的Ki67表达也随着IGF2BP3的过表达明显增强(图2D)。

A.皮下瘤成瘤情况;B.皮下瘤成瘤体重;C.皮下瘤体积监测;D.皮下瘤成瘤情况及IGF2BP3、Ki67在皮下瘤组织中的表达情况。图2 IGF2BP3过表达促进体内肝癌生长

2.3 IGF2BP3可激活肝癌细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路

IGF2BP3可通过激活PI3K/AKT信号通路促进甲状腺癌增殖、侵袭和肿瘤发生[12]。为了探究IGF2BP3在肝癌中的作用是否与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关,通过Western Blot检测发现,IGF2BP3过表达后,AKT、S6的磷酸化水平p-AKT、p-S6随之增强;而AKT、S6的表达没有变化(图3)。

图3 IGF2BP3激活肝癌细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号通路

2.4 IGF2BP3可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌细胞增殖

IGF2BP3可促进肝癌细胞增殖,为了进一步阐明IGF2BP3促肿瘤增殖作用是否与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关,将肝癌细胞分为对照组、IGF2BP3过表达组、IGF2BP3过表达+AKT抑制剂MK-2206处理组,通过Western Blot法检测了IGF2BP3、AKT、S6及其磷酸化水平,结果表明MK-2206可抑制AKT及S6的磷酸化水平,但不影响AKT、S6表达(图4A)。通过CCK-8实验、EdU实验证实IGF2BP3对肝癌细胞的促增殖作用与PI3K/AKT/mTOR信号通路的关系,CCK-8实验表明过表达IGF2BP3后OD值明显增强,使用MK-2206处理后其OD值明显下降(图4B)。

A.Western Blot结果;B.CCK-8实验检测肝癌细胞增殖能力;C.EdU量化图;D.EdU实验检测其阳性细胞数。差异的显著性由非配对t检验确定。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。图4 IGF2BP3可激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌细胞增殖

EdU结果与之一致,IGF2BP3过表达后肝癌细胞中EdU阳性细胞数明显增多,而在使用MK-2206作用后,其EdU阳性细胞数明显下降(图4C,图4D)。由此可见,过表达IGF2BP3可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌细胞增殖。

3 讨论

IGF2BP3作为IGF2BPs家族的一员,在肿瘤的发生发展中有着充分的研究。在多种恶性肿瘤中,IGF2BP3高表达与预后不良密切相关[13]。在乳腺癌中,IGF2BP3可通过上调乳腺癌PD-L1的表达和稳定性,在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用[14]。在胃癌中,IGF2BP3可与circARID1A结合促进肿瘤增殖[15]。在肝癌中,有报道揭示了IGF2BP3-NRF2轴在肝细胞癌中铁死亡中的作用,为提高索拉非尼疗效的新抗癌策略提供了重要证据[16];也有研究表明IGF2BP3可与LINC00467结合来增强肝癌中TRAF5(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 5,肿瘤坏死因子受体相关因子5)的mRNA稳定性,从而促进细胞增殖和转移[17]。但IGF2BP3在肝癌中的作用及潜在作用机制仍需进一步探究,为肝癌的早期诊断及治疗提供充分的理论依据。

本课题组前期已通过TCGA数据库及免疫组化验证了IGF2BP3在肝癌组织中高表达,为了评估过表达IGF2BP3对肝癌增殖的作用,本实验首先通过体外实验评估IGF2BP3对于肝癌细胞的作用。qRT-PCR实验表明慢病毒转染后,肝癌细胞中IGF2BP3 mRNA的表达水平明显升高;IGF2BP3的过表达明显促进肝癌细胞的增殖。体内实验进一步证实,IGF2BP3过表达后皮下瘤的体积及重量明显增大。免疫组化结果验证,IGF2BP3在过表达组中高表达,代表其增殖能力的Ki67表达也随之增强。由此可见,IGF2BP3的过表达明显促进了肝癌的生长。

PI3K/AKT/mTOR通路是最重要的信号通路之一,常被报道与人类癌症有关[18]。有研究表明有报道称PI3K/AKT/mTOR信号通路可调节肝癌细胞代谢的机制,包括葡萄糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、嘧啶代谢和氧化代谢[19]。且有研究表明,IGF2BP3可激活PI3K/AKT信号通路促进甲状腺癌的增殖、侵袭和转化[12]。PI3K/AKT/mTOR信号通路可通过活化的PI3K诱导AKT磷酸化,活化的AKT通过磷酸化mTOR及其下游分子促进细胞存活[20]。磷酸-S 6核糖体蛋白(Phospho-S6 ribosomal protein)是靶向mTOR治疗的一种潜在的预测标志物,磷酸化S6核糖体蛋白表达水平可预测肿瘤对mTOR抑制剂的早期反应[21]。为了进一步明确IGF2BP3在肝癌中与PI3K/AKT/mTOR信号通路之间的关系。多种生长因子激活磷脂酸肌醇3-激酶(PI3K),在质膜上产生第二信使PIP3,然后第二信使与信号蛋白AKT和PDK1结合,促使AKT的活化,并最终激活mTORC1复合体,使下游靶标蛋白磷酸化,调控蛋白翻译合成和细胞生长等。我们通过Western Blot检测IGF2BP3过表达后PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白AKT、S6及其磷酸化的表达水平,结果显示随着IGF2BP3的过表达,p-AKT、p-S6表达水平增强,由此说明过表达IGF2BP3可改变AKT的蛋白结构并使其活化,以磷酸化作用激活下游mTORC1的活性,导致其下游蛋白p-S6的激活。为了探究IGF2BP3对肝癌的促增殖作用是否与PI3K/AKT/mTOR信号通路相关,本实验使用AKT抑制剂MK-2206处理过表达IGF2BP3肝癌细胞系,并通过WB实验验证其蛋白表达。结果提示:IGF2BP3过表达后,其IGF2BP3、p -AKT、p-S6蛋白水平增强;而使用MK-2206处理过表达IGF2BP3肝癌细胞,其p-AKT、p-S6水平降低;IGF2BP3、AKT、S6表达水平不变。CCK-8、EdU实验结果表明,IGF2BP3可通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肝癌细胞的增殖。

综上所述,本研究发现,过表达IGF2BP3可通过上调p-AKT、p-S6的表达促进体外和体内肝癌细胞增殖。上述机制的阐明,为肝癌的发生发展提供新的理论依据,同时为肝癌的临床治疗提供可能的靶点。