NFATc3敲除对肝癌细胞转录组的影响及其潜在靶基因的初步筛选

杨菁,关贵文,张婷,王竞州,陈香梅,*

(1 石河子大学医学院,新疆 石河子 832000;2 北京大学基础医学院病原生物学系,北京 100191)

NFATc3是活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)家族成员之一,广泛表达于淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等多种免疫细胞,以及心肌细胞、肝细胞、内皮细胞和神经元细胞等多种组织细胞中。作为一种转录因子,NFATc3可调控肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF α)、白细胞介素(interleukin,IL)和干扰素(interferon,IFN)等多种细胞因子的表达[1],参与机体免疫应答[2]、血管生成、细胞增殖、细胞侵袭迁移等过程的调控[3]。研究发现,NFATc3基因异常表达与乳腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和血液肿瘤等多种恶性肿瘤发生有关[4]。

本实验室前期研究发现,NFATc3在肝癌组织中的异常低表达与肝癌的发生发展密切相关[5]。在肝细胞中,NFATc3可直接结合到IFNβ1和IFNλ1基因启动子区的固有识别序列,并协同RIG-I信号通路转录激活IFN表达,进而发挥抑制HBV复制和抗肿瘤的功能。但NFATc3在肝癌细胞中调控的潜在靶基因及在肝癌发生发展中的作用尚未完全阐明。

本研究采用转录组测序(RNA sequencing,RNA-Seq)技术检测了NFATc3基因敲除对肝癌细胞系SMMC7721转录组的影响,并对NFATc3可能调控的靶基因进行了预测分析和初步验证。本研究结果将为明确NFATc3调控的靶基因及寻找新的抗肝癌治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

肝癌细胞系Huh7、SMMC7721购自中科院上海细胞库,HepG2细胞购自ATCC细胞库。细胞培养液DMEM购自Gibco公司;胎牛血清、青-链霉素双抗试剂和胰酶购自Thermo公司;转染试剂 lipo2000 和Lipofectamine RNAiMAX以及Trizol试剂购自Invitrogen 公司;PCDH-NFATc3 过表达质粒由本实验室前期构建;细胞蛋白裂解液 RIPA 购自上海碧云天公司;逆转录试剂盒和实时荧光定量试剂购自南京诺唯赞公司;引物由上海生工生物公司合成;NFATc3抗体购自Proteintech公司;β-tubulin抗体购自北京普利莱公司;HRP标记的鼠、兔二抗购自LI-COR公司;化学发光显影试剂购自Thermo公司。

1.2 细胞转染

将处于指数生长期的细胞使用胰酶消化后接种到培养板中,待细胞生长至60%～80%时进行转染。先将质粒/siRNA和转染试剂与opti-DMEM培养基分别孵育5 min,两者混匀孵育20 min,结束后将混合液加入细胞培养板中,每组设置3个细胞复孔。转染4～6 h后,更换为含10%胎牛血清的DMEM培养液。实验所用siRNA详见表1。

表1 siRNA序列名称及序列

1.3 蛋白印迹法(Western Blot)

检测总蛋白表达水平细胞培养六孔板每孔加入200 μL细胞蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1),按照说明书从细胞中提取总蛋白,并检测每组蛋白的浓度。

取相等适量的蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳结束后将蛋白从凝胶中电转到PVDF膜上,之后将膜放在5% 脱脂奶粉中,室温封闭2 h。封闭结束后,使用抗体杂交带孵育NFATc3和β-tubulin的抗体(用TBST按1∶1 000比例稀释),4 ℃孵育过夜;第二天,TBST缓冲液洗膜3次,每次10 min;使用杂交带孵育相应种属的二抗(用TBST按1∶1 000比例稀释),室温孵育2 h;TBST洗膜3次,每次10 min。最后滴加化学发光显色液,放入化学发光仪中,按照仪器操作流程设置相关参数后,曝光拍照,保存图片后分析数据。

1.4 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测mRNA表达水平

使用预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS) 清洗细胞2遍。每孔加入1 mL Trizol 细胞裂解液,按照说明书从细胞中提取总 RNA,并检测RNA 的纯度和浓度。

按照说明书,将RNA 转录成cDNA并进行qRT-PCR操作。取2 μL逆转录好的cDNA作为反应模板,按照2 × SYBR Green 480 反应液 10 μL、上、下游引物各1 μL和ddH2O 6 μL配制反应mix;使用罗氏480实时荧光定量PCR仪以:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸;40个循环数为反应条件。采用2-ΔCt方法,以actin作为内参计算基因相对表达量。所涉及到的定量引物见表2。

表2 引物序列汇总表

1.5 荧光素酶报告基因实验

分别在HepG2细胞转染PCDH-vector或PCDH-NFATc3和pGL3-S100A8或pGL3-S100A9质粒,并以Actin-Renilla质粒作为内参;转染36 h后弃去培养基,并用PBS漂洗2次,每孔加入250 μL 1x Passive lysis buffer充分裂解细胞,10 000 rpm离心10 min,吸取25 μL上清加入96孔全白不透光检测板中,在各孔中加入25 μL Luciferase Assay Reagent A试剂,检测荧光值A;随后加入25 μL Stop&Glo终止反应,检测荧光值B,计算A/B的比值以比较相对荧光素酶活性。

1.6 RNA-seq测序分析

收集有或无仙台病毒(SeV)感染的NFATc3基因稳定敲除SMMC7721细胞株及其对照细胞,使用Trizol 试剂提取细胞的总RNA。RNA测序由美吉生物完成。Hisat2(2.2.1)[6]用于读取映射,htseq-count用于计算基因count值[7]。

使用edgeR包对数据进行了归一化,并进行差异表达基因(different expression genes,DEGs)分析,选择FDR<0.01且|Fold Change|>1.5作为DEGs的筛选条件。使用STRING在线数据库(https://www.string-db.org/)[8]将DEGs绘制蛋白质互作网络(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)图。

1.7 GO和KEGG富集分析

对于功能富集分析,将所有DEGs映射到基因本体(Gene Ontology,GO)数据库中的通路,然后以P<0.05为阈值在DEG中搜索显著丰富的GO项。GO项分析分为3个亚组,即生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。所有DEGs均映射到京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库,并在P<0.05为阈值搜索显著富集的KEGG通路。

1.8 数据库分析

TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库中肝癌组织信息下载于MEXPRESS (https://mexpress.be)。利用Kaplan-Meier Plotter (www.kmplot.com)进行基因表达预后分析。利用JASPAR在线数据库(https://jaspar.genereg.net/)和ALGGEN-PROMO数据库(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)预测基因结合序列并验证结合位点。

1.9 统计学分析

本研究中涉及的统计分析采用R(4.2.1)软件进行。两组间的差异分析使用独立样本t检验。定量数据采用平均值±标准偏差(SEM)方法表示。P<0.05则认为具有统计学差异。其中ns表示无统计学差异;*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。

2 结果

2.1 NFATc3敲除细胞的RNA-seq分析

本研究前期用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了NFATc3基因稳定敲除SMMC7721细胞株,命名N3-KO细胞株,对照细胞为N3-WT[5]。为探究NFATc3对肝癌细胞转录组影响,对N3-WT组(WTM)和N3-KO组(KOM)细胞进行RNA-seq检测。主成分分析图和小提琴图结果显示(图1A,图1B),两组样本组内一致性较好,两组间差异明显。根据测序结果共筛选到677个DEGs(图1C,图1D),其中N3-KO细胞中表达上调DEGs有153个(up,1.5倍差异),表达下调DEGs有524个(down,1.5倍差异)。随后,我们对上述DEGs进行了GO和KEGG分析。结果显示,NFATc3基因稳定敲除影响的DEGs主要富集在代谢、细胞外基质、分泌和血管生成等GO通路中,并富集在细胞外基质、肿瘤、病毒感染和PI3K-Akt等KEGG通路中(图1E,图1F)。

A.SMMC 7721 N3-WT组和SMMC 7721 N3-KO组RNA-seq测序结果的PCA图,蓝色三角代表SMMC 7721 N3-WT组(WTM),橙色点代表SMMC 7721 N3-KO组(KOM)。B.WTM和KOM组细胞RNA-seq测序结果小提琴图分析。C.WTM和KOM组细胞RNA-seq测序结果火山图分析。D.WTM和KOM组细胞RNA-seq测序DEGs热图分析。E.WTM和KOM组细胞RNA-seq测序DEGs的GO富集分析。F.WTM和KOM组细胞RNA-seq测序DEGs的KEGG富集分析。图1 N3-KO和N3-WT细胞的RNA-seq测序分析

2.2 SeV感染下NFATc3敲除细胞的RNA-seq分析

本研究前期发现,NFATc3敲除减弱了RIG-I信号通路对IFN表达的转录激活作用。提示NFATc3可以协同RIG-I信号通路调控肝癌细胞内基因的表达。仙台病毒(Sendai virus,SeV)是一类双链RNA病毒,可引起天然免疫RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)以及下游信号分子活化,导致干扰素和炎性因子的产生。SeV作为一个经典的模式病毒,已经被广泛用于研究天然免疫通路的激活和信号转导机制。为了进一步探究NFATc3敲除对SeV感染激活天然免疫后肝癌细胞转录组的影响,我们对SeV感染24 h后的N3-WT组(WTS)及N3-KO组(KOS)细胞也进行了RNA-seq检测。结果显示,两组样本的组内一致性较好,两组间差异明显(图2A,图2B)。根据测序结果共筛选到1598个DEGs(图2C,图2D),其中表达上调DEGs有636个(up,1.5倍差异),下调DEGs有962个(down,1.5倍差异)。GO和KEGG富集分析结果显示,DEGs主要富集在发育和对维生素的反应等GO通路中,并富集在肿瘤、代谢、和PI3K-Akt等KEGG通路中(图2E,图2F)。

A.SeV处理24 h的SMMC 7721 N3-WT组(WTS)和SMMC 7721 N3-KO组(KOS)RNA-seq测序结果的PCA图,蓝色三角代表SMMC 7721 N3-WT组(WTS),橙色点代表SMMC 7721 N3-KO组(KOS)。B.WTS和KOS组细胞RNA-seq测序结果小提琴图分析。C.WTS和KOS组细胞RNA-seq测序结果火山图分析。D.WTS和KOS组细胞RNA-seq测序DEGs热图分析。E.WTS和KOS组细胞RNA-seq测序DEGs的GO富集分析。F.WTS和KOS组细胞RNA-seq测序DEGs的KEGG富集分析。图2 SeV感染的N3-KO和N3-WT细胞的RNA-seq测序分析

为了筛选在肝癌细胞中受NFATc3调控同时又在RIG-I信号通路激活后调控仍然存在的潜在靶基因,我们对有和无SeV感染激活天然免疫的N3-WT和N3-KO细胞RNA-seq的DEGs进行交集分析,共计获得449个DEGs(图3A)。其中,有30个基因在GO数据库中被注释为免疫相关基因,包括10个NFATc3敲除后上调的基因和20个下调的基因(图3B)。对这30个免疫相关基因使用STRING数据库进行蛋白质互作网络(Protein-protein interaction network,PPI)分析(图3C)。

A.有或无SeV处理的SMMC 7721 N3-WT组和SMMC 7721 N3-KO组RNA-seq DEGs取交集的韦恩图。B.交集中30个免疫相关基因的表达水平热图。C.免疫相关DEGs的蛋白质互作网络图。圆圈代表各个蛋白,线条代表两个蛋白之间的相互作用。图3 有或无SeV感染的SMMC 7721 N3-KO RNA-seq DEGs交集

结果显示GAPDH、小分子肽S100钙结合蛋白A8(S100 calcium binding protein A8,S100A8)和小分子肽S100钙结合蛋白A9(S100 calcium binding protein A9,S100A9)处于PPI网络的核心位置。既往文献报道,S100A8和S100A9[9]参与炎症过程和免疫反应的调节[10],并且在肿瘤生长中起重要作用[11]。而无论有无SeV处理NFATc3敲除均能上调S100A8和S100A9的表达水平,提示S100A8和S100A9可能是NFATc3在肝癌细胞中下调的重要下游靶基因。

2.3 S100A8/S100A9是NFATc3负调控的潜在靶基因

为验证NFATc3对S100A8和S100A9表达的影响,首先采用qRT-PCR实验检测NFATc3基因稳定敲除SMMC7721 N3-KO及其对照N3-WT细胞株S100A8和S100A9 mRNA水平。结果显示,敲除NFATc3基因后,S100A8和S100A9 mRNA水平均显著上调(图4A)。我们在肝癌细胞系Huh7细胞中瞬时转染了靶向NFATc3 mRNA的si-NFATc3和对照siRNA,Western blot实验结果显示转染si-NFATc3显著降低了Huh7细胞内源NFATc3蛋白水平,而qRT-PCR实验证实敲减NFATc3显著上调了S100A8和S100A9 mRNA水平(图4B)。此外,我们在内源NFATc3表达较低HepG2细胞中瞬时转染PCDH-NFATc3及PCDH-vector对照质粒,Western blot实验表明转染PCDH-NFATc3显著上调了HepG2细胞内的NFATc3蛋白水平,而qRT-PCR实验显示过表达NFATc3降低S100A8和S100A9 mRNA水平(图4C)。为探究NFATc3是否可直接调控S100A8和S100A9基因的转录,通过JASPAR在线数据库,对S100A8和S100A9启动子区进行分析。结果显示,S100A8和S100A9基因启动子区分别存在10个、7个NFATc3的结合位点(图4D)。

A.SMMC7721 N3-KO和N3-WT细胞株的S100A8和S100A9 mRNA水平。B.Huh7细胞中敲减NFATc3后S100A8和S100A9 mRNA水平。C.HepG2细胞过表达NFATc3后S100A8和S100A9 mRNA水平。D.S100A8和S100A9启动子区上NFATc3的结合位点。E.双荧光报告基因实验检测过表达NFATc3对S100A8或S100A9启动子区活性影响。T test,**表示P<0.01;***表示P<0.001;****表示P<0.000 1。图4 NFATc3可能的靶基因S100A8/S100A9的验证

进一步在HepG2中分别转染含有S100A8或S100A9启动子区序列的荧光素酶报告质粒(PGL3-S100A8或PGL3-S100A9)及PCDH-vector或PCDH-NFATc3过表达质粒,以Actin-Renilla作为内参。双荧光素酶报告基因结果显示,过表达NFATc3后S100A8和S100A9启动子区荧光素酶活性均下调且有统计学差异,提示转录因子NFATc3可能通过直接结合S100A8和S100A9的启动子区从而负向调控S100A8和S100A9表达。

2.4 S100A8/S100A9异常表达促进肝癌的进展

为了探究S100A8/S100A9在肝癌发生发展中可能发挥的作用,我们利用TCGA数据库,分析了S100A8/S100A9在肝癌组织中的表达。结果表明,肝癌组织和癌旁组织中S100A8(P<0.000 1)和S100A9(P=0.012 8)均存在显著差异(图5A)。此外,利用Kaplan-Meier Plotter数据库进一步分析后发现,S100A8(P=0.032)、S100A9(P=0.000 13)和S100A8+S100A9(P=0.000 023 )高表达与肝癌患者的不良预后有关(图5B)。上述结果提示,S100A8和S100A9在肝癌发生发展中发挥促癌作用[12-17]。

A.TCGA数据库中S100A8/S100A9 mRNA表达水平。B.基于Kaplan-Meier Plotter数据库中S100A8、S100A9或S100A8+S100A9 mRNA水平绘制的肝癌患者总生存曲线。T test,*表示P<0.05;****表示P<0.0001。图5 肝癌中S100A8/S100A9的表达水平及预后

3 讨论

肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,但其发生发展的分子机制目前尚未完全阐明。我们前期研究发现,NFATc3可以上调肝细胞中IFNβ1和IFNλ1表达从而发挥抑制HBV复制和抗肝癌双重作用,且NFATc3低表达与肝癌患者不良预后有关,提示NFATc3发挥抑癌作用[5]。作为一种转录因子,NFATc3蛋白活化入核后往往需要以同源或异源二聚体的形式与其它转录因子结合,协同发挥转录调控作用。在免疫细胞中,NFATc3主要转录激活IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α和IFN-γ等细胞因子。但在其他组织细胞中,已经确定的NFATc3靶基因较少。本研究首次采用RNA-seq技术,对敲除NFATc3基因的SMMC7721细胞进行了转录组分析,并发现S100A8和S100A9可能是受NFATc3负调控的下游靶基因。

研究发现,NFATc3的缺失或低表达与多种肿瘤的发生发展有关[18-19]。NFATc3可通过负调控Ras-JNK1/2-AP-1通路抑制小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的增殖活性[20],而且在Nfatc3基因敲除的小鼠中更易发生淋巴肿瘤与乳腺肿瘤。我们前期研究也发现,NFATc3在肝癌组织中呈显著低表达,体外实验表明NFATc3可抑制肝癌细胞的增殖和迁移能力。已有文献报道,NFAT家族蛋白具有调节细胞周期、免疫应答、细胞凋亡及血管生成等功能[2,21],但NFATc3异常表达对肝癌细胞的功能影响目前尚未明确。本研究发现,在肝癌细胞中敲除NFATc3基因后,其影响的宿主基因功能主要富集在发育、代谢、细胞外基质和血管生成等GO通路以及细胞外基质、代谢、病毒感染、肿瘤和PI3K-Akt等KEGG通路中。上述GO以及KEGG通路都与肿瘤的发生发展密切相关,提示NFATc3基因敲除可能通过影响肝癌细胞的发育、代谢、肿瘤与免疫等通路相关基因,进而发挥抗肿瘤作用。

为了筛选受NFATc3转录调控的潜在靶基因,我们将有无SeV感染的两组RNA-seq筛选到的DEGs做了交集分析,这部分基因代表的是受NFATc3调控且在SeV感染下仍然发生表达差异的宿主基因。鉴于NFATc3具有抗HBV感染和抗肝癌细胞增殖的作用,二者均与宿主细胞的免疫功能有关,我们选取了DEGs交集中的30个免疫相关基因,进行了PPI蛋白互作分析。我们发现S100A8、S100A9位于网络互作图的核心位置,且敲减或过表达实验均证实NFATc3可以下调肝癌细胞中S100A8、S100A9的表达。S100A8/S100A9属于S100蛋白家族成员,二者通常以异二聚体的形式存在。S100A8/S100A9不仅参与炎症反应,而且还在多种自身免疫病以及癌症发展中发挥重要作用[10]。在食管鳞状细胞癌中,S100A8/A9在肿瘤细胞和肿瘤浸润免疫细胞中均呈高表达[13,22],并可通过激活Akt和p38 MAPK信号通路促进肿瘤的进展[23]。在DEN诱导的小鼠肝癌模型中,S100A9基因敲除小鼠的肿瘤细胞增殖减少[17]。外源性表达S100A9可激活MAPK/c-Jun信号通路,促进肝癌细胞的体外增殖和侵袭[24]。上述结果提示,S100A8/A9二聚体可能通过影响肝脏肿瘤微环境,增强肿瘤细胞的增殖和迁移/侵袭等能力,从而促进肝脏肿瘤发生[12]。通过qRT-PCR实验我们发现NFATc3可以负调控S100A8和S100A9的mRNA水平,同时S100A8和S100A9启动子区均存在多个NFATc3的潜在结合位点([T]GGAAA),且双荧光素酶报告基因实验证实NFATc3能下调S100A8和S100A9的启动子区活性,提示NFATc3可通过影响S100A8和S100A9的启动子区活性从而负向调控S100A8和S100A9的表达。但是,NFATc3是否通过与S100A8和S100A9的启动子区结合还需通过ChIP实验加以验证。此外,已有文献报道NFATc3可以与多个转录因子如AP1、GATA4和FOXP3等结合,协同发挥转录调控作用[25]。因此,NFATc3是否结合并协同负向调控S100A8和S100A9基因启动子的转录因子,进而抑制S100A8和S100A9表达也需未来深入探究。现有S100A8/A9特异性抑制剂帕奎莫德(Paquinimod),可通过结合S100A9并抑制其与TLR4/MD2和RAGE的相互作用[26]。但S100A8/A9抑制剂在肝癌中的作用尚未见文献报道,其是否可以用于肝癌治疗的靶向药物尚需更多的基础及临床探究。

综上所述,本研究发现肝癌细胞中敲除NFATc3基因主要影响发育、代谢、病毒感染、血管生成和PI3K-Akt等通路,且S100A8和S100A9可能作为NFATc3负调控的下游靶基因参与NFATc3的抗HBV和抗肝癌作用。本研究不仅为明确NFATc3的功能及调控靶基因提供理论依据,也将为开发新的肝癌治疗药物提供潜在靶点。