基于生物信息学方法分析SHCBP1基因在肺腺癌中的表达及临床意义①

连岩岩 万宇翔 李丽玲 张春光 黄金昶 （北京中医药大学第三附属医院，北京100029）

肺癌是发病率及病死率最高的癌症之一，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是一种常见的肺癌病理亚型，其发病隐匿，具有早期转移趋势，确诊时多处于晚期，五年生存率仅为15%［1-3］。因此，挖掘新的与LUAD 发生发展密切相关的基因，对于改善患者预后具有重要意义。

SHC 蛋白被认为是与细胞表面受体相关的结合蛋白，在信号传导和疾病发生中发挥重要作用，SHC 的SH2 结 构 域 结 合 蛋 白1（SHC SH2-binding protein 1，SHCBP1）是SHC 蛋白SH2 结构域上的重要连接蛋白［4］。SHCBP1参与多种肿瘤的发生发展，并可调节FGF、NF-κB、PI3K/AKT、TGF-β1/Smad 等多种信号通路［4］。目前关于SHCBP1 在LUAD 中表达的相关研究较少，本研究利用多种常用公共数据库中LUAD 的临床数据，挖掘SHCBP1在LUAD 中的表达水平及其与LUAD预后的关系，并评估SHCBP1与肿瘤浸润性免疫细胞、免疫标志物及免疫检查点的相关性，为临床进一步深入探究SHCBP1在LUAD发生发展中的作用及免疫细胞浸润提供参考。

1 资料与方法

1.1 Oncomine 数据库 Oncomine 数据库（https：//www.oncomine.org）是目前世界上最大的在线癌基因芯片数据库和整合数据挖掘平台，可对正常组织和肿瘤组织的差异表达基因进行分析［5］。根据本研究需求，设定具体筛选条件：①gene：输入SHCBP1；②Analysis Type：选择Cancer vs Normal Analysis；③Cancer Type：选择Lung Cancer；④Data Type：mRNA；⑤临 界 值 设 定：P<0.000 1，FOLD CHANGE>2，GENE RANK=10%，分析SHCBP1 mRNA 在肿瘤组织与正常组织间的表达差异。

1.2 TIMER 数 据 库 TIMER 数 据 库（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）提供了肿瘤浸润免疫细胞的全面分析和可视化功能，可系统性地分析不同癌症类型免疫细胞浸润［6］。通过反卷积方法估算肿瘤组织中6 种免疫细胞（B 细胞、CD4+T 细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞）浸润的丰度。本研究用Diff Exp 模块分析SHCBP1 mRNA在肿瘤组织和正常组织中的表达差异；Gene 模块分析SHCBP1 mRNA 表达和各种免疫细胞浸润的关系；Survival 模块分析肿瘤免疫细胞浸润水平对LUAD 患者预后的影响；Correlation 模块分析SHCBP1 mRNA与LUAD免疫浸润细胞标志物、免疫检查点之间的相关性。

1.3 GEPIA 数据库 GEPIA 数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）是由北京大学开发的交互式Web 服务器，提供基因差异表达分析、轮廓图绘制、相关性分析、生存分析等功能［7］。本研究应用GEPIA 分析SHCBP1 mRNA 在LUAD 组织中的表达水平及其对LUAD 患者预后的影响，进一步分析SHCBP1 mRNA与免疫检查点间的关系。

1.4 UALCAN 数 据 库 UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/）是癌症基因组学门户网站［8］，数据主要来源于TCGA 数据库，可用于分析基因在肿瘤和正常样本中的差异性表达，同时可以比较不同肿瘤临床特征与基因表达的相关性。使用该网站分析LUAD患者的临床特征与SHCBP1 mRNA表达情况。

1.5 Kaplan-Meier plotter 数 据 库 Kaplan-Meier plotter （www.kmplot.com）在线数据库是一个肿瘤预后分析的在线网站［9］，用于评估SHCBP1 mRNA表达对LUAD患者预后的影响。

1.6 STRING 数据库 通过STRING 数据库分析与SHCBP1 有相关作用的基因及蛋白，并进行KEGG通路富集分析，以期预测SHCBP1 发挥作用的可能机制。

2 结果

2.1 SHCBP1 在常见恶性肿瘤中的表达情况 在Oncomine 数据库中，根据筛选条件分析了不同肿瘤和各正常组织中SHCBP1 mRNA 的表达水平，结果提示共有293 项不同类型的研究结果（图1A），其中差异有统计学意义的研究结果有54 项，SHCBP1 mRNA 表达增高的研究有49 项，表达降低的研究有5项，红框中是SHCBP1 mRNA 在肺癌中的差异表达情况，显示SHCBP1 mRNA 在肺癌中高表达。采用TIMER 数据库进一步比较SHCBP1 mRNA 在不同肿瘤组织和正常组织中的表达差异，发现LUAD 中SHCBP1 mRNA 表达明显高于正常肺组织，差异有统计学意义（P<0.001，图1B）。

图1 SHCBP1 mRNA在不同肿瘤中的表达Fig.1 Expression of SHCBP1 mRNA in different tumors

2.2 LUAD 中SHCBP1 mRNA 的表达情况 在Oncomine 数据库中，通过上述检索条件，共找到3 项关于LUAD 和正常肺组织中SHCBP1 芯片表达的研究（表1）。荟萃比较结果提示（图2A），相比正常肺组织，SHCBP1 mRNA 在LUAD 中的表达显著升高（Median Rank=594，P<0.000 1）。通过GEPIA 数据库，在LUAD 组织中进一步验证SHCBP1 的转录水平，结果证实SHCBP1 mRNA 在LUAD 组织中表达明显升高（图2B）。

表1 Oncomine 数据库中SHCBP1 在LUAD 与正常肺组织中的表达水平Tab.1 Expression level of SHCBP1 in Oncomine database in LUAD and normal lung tissues

图2 SHCBP1 mRNA在LUAD中的表达Fig.2 SHCBP1 mRNA expression in LUAD

2.3 SHCBP1 与LUAD 临床特征的关系 通过UALCAN 数据库对LUAD 患者的SHCBP1 mRNA 水平与临床特征的关系进行分析。结果显示，与正常肺组织相比，SHCBP1 mRNA 在高加索人、非裔美国人、亚洲人种均表达上升，差异有统计学意义（P<0.01），而各人种间差异无统计学意义（图3A）；吸烟患者与戒烟患者SHCBP1 mRNA 表达均明显上升（P<0.01），提示SHCBP1 mRNA 表达上升与有吸烟史密切相关（图3B）；男性和女性SHCBP1 mRNA 表达差异无统计学意义（图3C）；SHCBP1 mRNA 表达与淋巴结转移密切相关，N0、N1、N2 期SHCBP1 mRNA表达均显著高于正常肺组织（P<0.000 1），N3与N2相比有上升趋势，但差异无统计学意义（图3D）；Ⅰ期与Ⅲ期和Ⅳ期SHCBP1 mRNA 表达差异有统计学意义（P<0.05），Ⅲ期与Ⅳ期SHCBP1 mRNA 表达相比有上升趋势，提示分期越晚SHCBP1 mRNA 表达水平越高（图3E），表明可依据SHCBP1 mRNA 表达水平作为判断分期的指标；存在TP53 突变的LUAD 组织中SHCBP1 mRNA 表达明显高于不存在TP53突变的LUAD组织（P<0.000 1，图3F）。

图3 SHCBP1 mRNA与LUAD患者临床特征的关系Fig.3 Relationship between SHCBP1 mRNA and clinical features of LUAD patients

2.4 SHCBP1 mRNA 表达与LUAD 患者预后的关系 GEPIA 数据库分析SHCBP1 mRNA 表达与LUAD 患者预后的关系。预后分析结果显示，与SHCBP1 mRNA 低表达组相比，SHCBP1 mRNA 高表达组LUAD 患者总生存期显著降低（HR=1.8，P<0.001，图4A），结果通过Kaplan-Meier plotter 数据库得到验证（HR=1.72，P<0.000 1，图4B），表明SHCBP1 mRNA高表达的LUAD患者预后较差。

图4 SHCBP1 mRNA表达与LUAD患者预后的关系Fig.4 Relationship between expression of SHCBP1 mRNA and prognosis of LUAD patients

2.5 SHCBP1 的蛋白互作网络及KEGG 通路富集分析 通过STRING 数据库对SHCBP1 进行蛋白互作网络构建，根据蛋白关联性共获得与SHCBP1 相关的蛋白10个，该网络平均连接度为8.36，SHCBP1的连接度为10，为网络的核心（图5）。KEGG 通路富集发现，存在5个与免疫密切相关的条目（表2）。

表2 SHCBP1相互作用蛋白的KEGG通路富集分析Tab.2 KEGG pathway enrichment analysis of SHCBP1 interacting proteins

图5 SHCBP1相关基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络Fig.5 Protein-protein interaction network of SHCBP1 related genes

2.6 LUAD 中免疫细胞浸润水平与SHCBP1 mRNA表达的关系 利用TIMER 数据库检测LUAD 中肿瘤免疫细胞浸润水平与SHCBP1 mRNA 表达的相关性（图6）。在LUAD 中，SHCBP1 mRNA 表达与肿瘤纯度呈负相关（cor=-0.098，P<0.05），与B细胞浸润呈负相关（cor=-0.141，P<0.01），与CD8＋T细胞（cor=0.120，P<0.01）、中性粒细胞（cor=0.243，P<0.000 1）和树突状细胞（cor=0.132，P<0.01）的浸润呈正相关。

图6 LUAD中免疫细胞浸润水平与SHCBP1 mRNA表达的关系Fig.6 Relationship between immune cell infiltration level and SHCBP1 expression in LUAD

2.7 LUAD中SHCBP1 mRNA表达水平与免疫细胞浸润程度对预后的影响 利用TIMER 数据库生成Kaplan-Meier 曲线，以研究SHCBP1 mRNA 表达水平与免疫细胞浸润程度对LUAD 预后的影响（图7）。结果发现B 细胞浸润（P<0.001）、树突状细胞浸润（P=0.048）和SHCBP1 mRNA 表 达（P<0.001）与LUAD 预后显著相关，B 细胞、树突状细胞浸润低的LUAD 患者预后较差，SHCBP1 高表达的LUAD 患者预后较差。

2.8 LUAD中SHCBP1 mRNA表达与不同类型免疫细胞标志物的相关性 本研究利用TIMER 数据库探讨了LUAD 中SHCBP1 mRNA 表达水平与不同类型免疫细胞标志物的相关性，包括CD8+T 细胞、B 细胞、单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、Th1 细胞、Th2 细胞、滤泡辅助性T细胞、辅助性T 细胞17、Treg 细胞和T 细胞耗竭标志物（表3）。经肿瘤纯度校正后发现，LUAD 中的SHCBP1 表达水平与CD8+T 细胞、单核细胞、肿瘤相关巨噬细胞、M2 型巨噬细胞、T 细胞耗竭表面标志物呈正相关（0.1≤cor≤1.0，P<0.05）。

表3 LUAD中SHCBP1与免疫细胞标志物的相关性Tab.3 Correlation between SHCBP1 and immune cell markers in LUAD

2.9 SHCBP1 mRNA与LUAD免疫检查点的关系由于PD-1/PD-L1 和CTLA-4 是负责肿瘤免疫逃逸的重要免疫检查点。考虑到SHCBP1 在LUAD 中的潜在致癌作用，应用TIMER 评估了SHCBP1 mRNA 与PD-1、PD-L1 和CTLA-4 的关系。经肿瘤纯度校正后发现，SHCBP1表达与LUAD中PD-1、PD-L1和CTLA-4的表达呈显著正相关（图8A、C、E），且结果通过GEPIA 数据库得到了验证（图8B、D、F）。提示肿瘤免疫逃逸可能与SHCBP1介导的LUAD发生有关。

图8 SHCBP1与LUAD中PD-1、PD-L1和CTLA-4的相关性Fig.8 Correlation of SHCBP1 expression with PD-1， PDL1 and CTLA-4 expressions in LUAD

3 讨论

本研究利用多个数据库分析了LUAD 组织和正常肺组织中SHCBP1 的表达水平及其与LUAD 临床特征、预后及肿瘤免疫浸润的关系。结果发现，与正常肺组织相比，SHCBP1 mRNA 在LUAD 中高表达，且SHCBP1 mRNA 表达与有吸烟史、淋巴结转移、TP53 突变密切相关。HU 等［13］研究发现吸烟显著影响P53 信号通路，可能有助于LUAD 的发病。此外本研究发现LUAD分期越晚，SHCBP1 mRNA表达水平越高，提示可依据SHCBP1 表达水平作为判断分期的指标。生存分析发现SHCBP1 mRNA 的高表达与LUAD 患者较差的总生存期显著相关。WANG 等［14］研究发现SHCBP1 的表达可能在肺癌中上调；ZOU 等［15］研究发现SHCBP1 高表达的肺癌患者预后较差。这些结果与本研究的发现大致相符，提示SHCBP1 高表达与LUAD 的发生发展及不良预后有关，但具体机制尚不清楚。

肺癌的发展是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞、基质成纤维细胞和免疫细胞间的相互作用，肿瘤浸润免疫细胞在促进或抑制肿瘤生长中起重要作用，癌症的恶性表型与肿瘤浸润免疫细胞密切相关［16-17］。通过STRING 构建SHCBP1 相关蛋白网络，并进行KEGG 通路富集分析，结果显示有5 条通路与免疫密切相关，包括病毒致癌、人类T细胞白血病病毒1 感染、细菌入侵上皮细胞、NK 细胞介导的细胞毒性、乙型肝炎通路，SHCBP1 可能通过调控上述通路影响LUAD 的发生发展和免疫浸润。本研究进一步挖掘了SHCBP1 mRNA 与LUAD 免疫浸润的关系，结果显示SHCBP1 mRNA 的表达水平与肿瘤纯度、B 细胞浸润呈负相关，与CD8+T 细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润呈正相关。提示SHCBP1可能参与对LUAD 肿瘤微环境的免疫应答，尤其是对B 细胞、CD8+T 细胞、中性粒细胞和树突状细胞的免疫应答。另外，经肿瘤纯度校正后发现SHCBP1 mRNA 的表达与大部分免疫标志物显著相关，尤其与CD8+T细胞、单核细胞、肿瘤相关巨噬细胞、M2型巨噬细胞、T 细胞耗竭表面标志物表达水平有很强的正相关性，表明SHCBP1 可能通过调节以上免疫细胞影响LUAD 的免疫浸润。越来越多的证据表明，高水平CD4+T、CD8+T、树突状细胞和B 细胞浸润的LUAD 患者预后较好［18-19］。本研究经TIMER 数据库生存分析发现，B 细胞浸润低的LUAD 患者预后较差。肺癌发展的所有阶段均观察到肿瘤浸润性B细胞，其分泌抗体激活补体级联和NK 细胞以杀死肿 瘤 细 胞［16，20］。M2 极 化 的 巨 噬 细 胞 在 体 内 促 进LUAD 细胞的侵袭、迁移和转移［21］。因此，SHCBP1过表达可能抑制LUAD 中B 细胞的浸润，促进M2 型巨噬细胞浸润，并最终加速LUAD进展。SHCBP1在LUAD 患者中的高表达可能触发抗肿瘤免疫反应，提示SHCBP1在LUAD的免疫调节中起重要作用。

肿瘤免疫逃逸使肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的识别和攻击，导致其增殖和转移［22］。免疫治疗的疗效不仅需要肿瘤微环境中有足够的免疫细胞浸润，还取决于免疫检查点的充分表达［23］。有研究表明具有TP53 突变的非小细胞肺癌患者在接受免疫检查点阻断治疗后有更好的预后，CD8+T细胞浸润水平较高的患者更有可能从免疫治疗中获益，并且有研究发现肿瘤PD-L1 表达与CD8+T 细胞计数显著正相关［24-26］。本研究中SHCBP1 mRNA表达与TP53 突变和CD8+T 细胞浸润显著正相关。因此本研究评估了SHCBP1 mRNA 与免疫检查点间的关系，结果表明SHCBP1 mRNA 高表达与LUAD中的PD-1、PD-L1和CTLA-4呈正相关。以上结果表明SHCBP1可能通过增加免疫检查点表达发挥其致癌作用，靶向SHCBP1 可能提高LUAD 免疫治疗的疗效。

综上所述，本研究探讨了SHCBP1 作为LUAD生物标志物的潜力及其在肿瘤细胞浸润中发挥的作用。但受数据库数据限制本研究也存在一定的局限性，SHCBP1 mRNA 转录与蛋白表达的一致性仍有待进一步明确，未来仍需应用分子生物学方法通过体内外实验加以验证。