川续断皂苷Ⅵ对M1/M2型巨噬细胞极化的调节作用及机制①

罗进芳 刘 明 杨 虹 钱海兵 （贵州中医药大学基础医学院药理学教研室，贵阳 550025）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis， RA）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，基因和环境因素均会影响其发生发展［1］。RA 疾病发展过程中，多种因素会打破处于动态平衡的M1/M2 型巨噬细胞，引起数量和比例失衡，导致M1 型促炎巨噬细胞不断增多，从而加剧炎症反应［2-3］。

M1巨噬细胞主要分泌促炎细胞因子，如TNF-α引起关节损伤，抑制M1 型巨噬细胞极化可以改善关节炎［4］。M2 巨噬细胞释放大量抗炎细胞因子促进组织重塑和修复，抑制RA 的进展［5］。因而，研究中医药调节巨噬细胞极化发挥抗炎作用治疗RA 具有重要临床指导意义和研究价值。

续断，又名川续断，是川续断科植物川续断（Dispsalus asper wall.ex.Henry）的干燥根，具有补肝肾、强筋骨等疗效［6］。续断常作为骨伤科用药被用于骨折愈合、风湿痹痛等的治疗［7］。研究表明，续断总皂苷对膝骨关节炎模型大鼠具有明显的保护作用［8］。川续断皂苷Ⅵ是续断的主要有效成分之一，研究表明，川续断皂苷Ⅵ可以抑制一氧化氮合酶（iNOS）和一氧化氮（NO）发挥其抗炎作用［9］。

但目前未见川续断皂苷Ⅵ通过调节巨噬细胞极化发挥其抗炎作用的研究报道。本研究以巨噬细胞RAW264.7 为实验研究对象，探讨川续断皂苷Ⅵ对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或IL-4 诱导条件下RAW264.7 巨噬细胞向M1/M2 极化的调节作用和机制，为川续断皂苷Ⅵ抗炎作用提供更多参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 RAW264.7 细胞株为小鼠来源巨噬细胞株，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.1.2 主要试剂 川续断皂苷Ⅵ，分析标准品，HPLC≥98%，购于德斯特生物技术有限公司；胎牛血清、DMEM购于Gibco公司；LPS购于Sigma公司；IL-4购于Peprotech 公司；TNF-α 和IL-6 ELISA 检测盒购于eBioscience 公司；RNA 提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒购于北京索莱宝公司；RNA 逆转录试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix 均购于Roche 公司；精氨酸酶-1（Arginase-1，Arg-1）、iNOS、TNF-α、HO-1 及内参βactin 引物均由生工生物工程股份有限公司合成；iNOS一抗购于Cell Signaling Technology公司；β-actin一抗购于Santa Cruz BioTechnology 公司；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗购于Absin；StarSignal 超敏化学发光检测试剂盒购于北京索莱宝公司。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7 细胞培养 RAW264.7 细胞用含有10%胎牛血清、1 000 U/L 青霉素和链霉素的完全DMEM培养基培养，置于5%CO2、37℃细胞培养箱进行常规传代培养。RAW264.7细胞生长至90%左右融合状态时进行传代。常规传代培养3 次后，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT 方法检测川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7细胞增殖活性影响 巨噬细胞按照1.4×104个/孔接种到96 孔细胞培养板内，每孔添加100 μl细胞悬浮液，培养过夜后，弃上清液，加入含有1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ的细胞培养液各100 μl，置于37 ℃培养箱内孵育培养18 h后，取出培养板，每孔分别加入10 μl MTT 溶液（5 g/L），37 ℃继续培养4 h，然后加100 μl 10%SDS-HCl 溶液。酶标仪测定570 nm（参比波长为650 nm）OD 值。计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD 值-空白对照组OD）/（对照组OD 值-空白对照组OD）×100%。

1.2.3 川续断皂苷Ⅵ作用于LPS诱导的RAW264.7细胞 取对数生长期RAW264.7 细胞进行细胞计数后，调整细胞密度，按3×105个/ml 密度2 ml/孔接种于6 孔板，实验分组设正常组、LPS 组、LPS+ASD（5 μmol/L）组、LPS+ASD（10 μmol/L）组、LPS+ASD（20 μmol/L）组，培养细胞生长至80% 融合状态时，按照实验分组给药组加入川续断皂苷Ⅵ至终浓度分别为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，加药1 h 之后，LPS 组与给药组均加LPS 至终浓度为100 ng/ml，正常组加等体积的培养基，加入LPS 后继续培养18 h 后，分别收集培养基、细胞、细胞上清液于-70 ℃保存备用。

1.2.4 川续断皂苷Ⅵ作用于IL-4 诱导的RAW264.7细胞 取对数生长期RAW264.7细胞计数后，调整细胞密度，按3×105个/ml 的密度，2 ml/孔接种于6 孔板，实验分组设正常组、IL-4 组、IL-4+ASD（5 μmol/L）组、IL-4+ASD（10 μmol/L）组、IL-4+ASD（20 μmol/L）组。培养细胞生长至90%融合状态时给药组加入不同浓度的川续断皂苷Ⅵ至终浓度分别为5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L，加药干预1 h之后，IL-4 组与给药组均加IL-4 至终浓度10 ng/ml，正常组加等体积的培养基，继续培养6 h 后，收集细胞于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2.5 检测细胞上清中TNF-α、IL-6 和NO 分泌量 收集1.2.3 中细胞培养上清液，参照ELISA 检测试剂盒说明书分别检测细胞上清中TNF-α、IL-6含量。参照Griess 试剂盒说明书检测细胞上清中NO的含量。

1.2.6 荧光定量PCR检测TNF-α、IL-6、HO-1、Arg-1和SOCS2 基因表达 按照实验分组收集细胞，按照提取RNA 试剂盒说明书步骤提取细胞总RNA，将RNA 按照按逆转录试剂盒说明书操作步骤，各组取1 μg RNA逆转录成cDNA。荧光定量PCR实验按照SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒说明书进行，反应条件为：95 ℃、30 s（预变性），95 ℃、5 s（变性），60 ℃、30 s（退火），40 个循环，β-actin 为内参对照。反应体系包括：SYBR Green 染料10 μl、正反向引物各1 μl、PCR 专用的无菌水7 μl、cDNA 模板1 μl。采用2-ΔΔCt法分析各组样本中TNF-α、IL-6、HO-1、Arg-1和SOCS2 mRNA相对表达水平（目的基因相对表达均进行归一化处理）。荧光定量PCR 引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR引物序列Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer sequences

1.2.7 Western blot 检测iNOS 和p-p65 蛋白表达按照1.2.3 实验分组，加不同浓度的川续断皂苷Ⅵ处理细胞1 h之后，按照实验分组分别加入LPS共同孵育，加LPS 刺激细胞30 min，检测p-p65 蛋白或18 h检测iNOS 蛋白后，分别收集提取加药处理后的细胞，按照RIPA 试剂说明书提取细胞总蛋白，BSA法进行蛋白定量后，按照50 μg/孔的蛋白上样量经SDS-PAGE 电泳将蛋白分离转至PVDF 膜，用5%脱脂奶粉室温孵育2 h，经TBST 洗涤3 次，分别加一抗，4 ℃孵育过夜，经TBST 洗涤3 次，每次5 min；室温二抗（辣根过氧化物酶标记，稀释比例为1∶2 000）孵育1～2 h，TBST 冲洗，ECL 显影发光。以 Image 分析条带的灰度值。β-actin 作为参照，用目的蛋白灰度值除以内参蛋白灰度值，并进行归一化处理后，分析计算iNOS、p-p65蛋白相对表达水平。

1.3 统计学分析 实验数据用 GraphPad Prism7统计软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，数据用±s表示，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7 细胞活力的影响 不同浓度川续断皂苷Ⅵ作用于RAW264.7 巨噬细胞后，MTT 结果显示（图1），1.25～20 μmol/L 的川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7 巨噬细胞无明显细胞毒性作用，40、80 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ明显抑制RAW264.7 巨噬细胞增殖，说明高浓度川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7 巨噬细胞有明显细胞毒性作用，选择5、10、20 μmol/L安全浓度的川续断皂苷Ⅵ用于后续实验研究。

图1 川续断皂苷Ⅵ对RAW264.7巨噬细胞活力的影响Fig.1 Effect of Asperosaponin Ⅵ on cell viability of RAW264.7 cells

2.2 川续断皂苷Ⅵ对LPS 诱导下RAW264.7 细胞TNF-α、IL-6 基因和蛋白表达的影响 与正常对照组细胞比较，加LPS 刺激细胞6 h后明显增加TNF-α和IL-6 基因表达水平，与LPS 组比较，加入5、10、20 μmol/L川续断皂苷Ⅵ组均可不同程度抑制TNF-α和IL-6 基因表达，且随着川续断皂苷Ⅵ药物浓度增加，对TNF-α 和IL-6 基因表达水平的抑制作用越明显，其中10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组明显抑制TNF-α和IL-6基因表达水平（P<0.01），见图2A、B。与正常对照组比较，LPS 刺激RAW264.7 细胞18 h后明显增加细胞上清中TNF-α和IL-6蛋白分泌量，与LPS组比较，加入5、10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组可不同程度抑制TNF-α 和IL-6 蛋白分泌量，且随着川续断皂苷Ⅵ药物浓度增加，对TNF-α和IL-6的蛋白抑制作用越明显（图2C、D），10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组明显抑制TNF-α 和IL-6 蛋白分泌（P<0.01）。

图2 川续断皂苷Ⅵ对LPS 诱导下RAW264.7 巨噬细胞TNF-α和IL-6蛋白和基因水平的影响Fig.2 Effect of Asperosaponin Ⅵ on TNF-α and IL-6 protein and gene levels in LPS stimulated RAW264.7 cells

2.3 川续断皂苷Ⅵ对LPS 诱导下RAW264.7 细胞iNOS和p-p65蛋白表达的影响 与正常对照组细胞比较，LPS 刺激细胞18 h 后明显增加RAW264.7 细胞iNOS 蛋 白 表 达，与LPS 组 比 较，加 入5、10、20 μmol/L 浓度的川续断皂苷Ⅵ均可不同程度抑制iNOS 蛋白表达水平，且随着川续断皂苷Ⅵ药物浓度增加，对iNOS 蛋白的抑制作用越明显（图3A），10、20 μmol/L 的川续断皂苷Ⅵ组明显抑制LPS 诱导下iNOS蛋白表达（P<0.01）。

图3 川续断皂苷Ⅵ对LPS 诱导下RAW264.7 巨噬细胞iNOS和p-p65蛋白水平的影响Fig.3 Effect of Asperosaponin Ⅵ on iNOS and p-p65 protein in LPS stimulated RAW264.7 cells

与正常对照组细胞比较，加LPS 刺激细胞30 min后明显增加RAW264.7细胞p-p65蛋白表达，与LPS组比较，提前1 h加入5、10、20 μmol/L 的川续断皂苷Ⅵ可不同程度抑制p-p65 蛋白表达水平，且随着川续断皂苷Ⅵ药物浓度增加，对p-p65 蛋白的抑制作用越明显（图3B），10、20 μmol/L 的川续断皂苷Ⅵ抑制LPS诱导下p-p65蛋白表达（P<0.05）。

2.4 川续断皂苷Ⅵ对LPS 诱导下RAW264.7 细胞HO-1基因表达和NO分泌的影响 与正常对照组细胞比较，LPS 刺激细胞6 h 后增加HO-1 基因表达水平，差异无统计学意义，与LPS 组比较，加入5、10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组均可不同程度增加HO-1基因表达，且随着川续断皂苷Ⅵ药物浓度增加，对HO-1 基因表达水平的增加作用越明显（图4A），10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组明显增加LPS 诱导下HO-1基因表达（P<0.01）。与正常对照组细胞比较，加LPS 刺激细胞18 h后明显增加细胞上清中NO 分泌量（P<0.01），与LPS 组比较，加入5、10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组均可不同程度地抑制NO 释放量，且随着川续断皂苷Ⅵ药物浓度增加，对NO 的抑制作用越明显（图4B），10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组明显抑制LPS诱导下NO的分泌量（P<0.01）。

图4 川续断皂苷Ⅵ对LPS 诱导下RAW264.7 巨噬细胞HO-1基因和NO水平的影响Fig.4 Effect of Asperosaponin Ⅵ on HO-1 gene and NO levels in LPS stimulated RAW264.7 cells

2.5 川续断皂苷Ⅵ对IL-4 诱导下RAW264.7 细胞Arg-1 和SOCS2 基因表达的影响 与正常对照组细胞比较，加IL-4 刺激细胞6 h 后明显增加Arg-1 和SOCS2 基因表达，与IL-4 组比较，加入5、10、 20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组均可不同程度增加Arg-1（图5A）和SOCS2（图5B）基因表达，Arg-1 和SOCS2基因表达水平与川续断皂苷Ⅵ浓度呈依赖性增长，20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组增加IL-4诱导下Arg-1的基因表达（P<0.05）。10、20 μmol/L 川续断皂苷Ⅵ组明显增加IL-4 诱导下SOCS2 的基因表达（P<0.01）。

图5 川续断皂苷Ⅵ对IL-4 诱导下RAW264.7 巨噬细胞Arg-1和SOCS2基因水平的影响Fig.5 Effect of Asperosaponin Ⅵ on Arg-1 and SOCS2 gene levels in IL-4 stimulated RAW264.7 cells

3 讨论

巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，在体内外不同环境影响下可极化为不同表型从而参与免疫调控［10］。巨噬细胞极化是一个动态变化、可被逆转的过程，其参与了众多免疫炎症性疾病的发生、发展过程［11］。

LPS 是革兰阴性菌细胞壁主要成分之一，具有较强的免疫刺激能力［12］。LPS 可诱导巨噬细胞向M1 型分化，产生促炎症细胞因子，IL-4 可以诱导巨噬细胞向M2型分化［13］。

川续断皂苷Ⅵ是中药川续断的主要活性成分，具有保护神经、抗骨质疏松、抗细胞凋亡等药理作用［14］，虽然川续断皂苷Ⅵ在药理作用方面应用前景广泛，但在炎症方面的报道却不多。有研究表明，M1巨噬细胞促进炎症反应，LPS可以通过激活NF-κB等信号通路，促进M1 型巨噬细胞标志物TNF-α 表达［15-17］。iNOS、TNF-α、IL-6是M1型巨噬细胞的促炎因子，被证实会增强炎症反应［18］。

本研究发现，以LPS 刺激小鼠RAW264.7 细胞可致其M1 型巨噬细胞标志分子TNF-α、IL-6 分泌量增多及iNOS基因和蛋白表达升高；川续断皂苷Ⅵ能明显抑制LPS 诱导下小鼠RAW264.7 细胞分泌TNF-α 和IL-6，同时抑制iNOS 和TNF-α 基因表达水平。M1 型巨噬细胞产生大量NO，川续断皂苷Ⅵ能显著抑制M1 型巨噬细胞iNOS 蛋白表达，从而进一步下调NO 产生。以上研究结果表明川续断皂苷Ⅵ可以通过抑制LPS 诱导下小鼠RAW264.7 细胞的M1型极化发挥其抗炎作用。机制研究发现，川续断皂苷Ⅵ能抑制NF-κB 通路中p-p65 蛋白磷酸化水平，说明川续断皂苷Ⅵ能抑制NF-κB 信号通路发挥其对M1 型巨噬细胞的抑制作用，从而发挥其抗炎作用。

核因子E2 相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）通路的激活可以抑制炎症反应，Nrf2 通路可以通过与各种炎症相关基因的近端调控区结合，直接抑制M1 型巨噬细胞诱导表达的炎症基因［19-20］。激活Nrf2 信号通路可以抑制M1 巨噬细胞极化的同时促进M2 型巨噬细胞极化［21］。本研究发现，川续断皂苷Ⅵ能增加LPS 诱导状态下细胞中Nrf2 通路下游的血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）基因水平，说明川续断皂苷Ⅵ很可能通过激活Nrf2 下游HO-1 基因表达发挥其对M1 巨噬细胞极化的抑制作用。

此外，Arg-1是M2型巨噬细胞的标志性分子［22］，本研究以IL-4 刺激小鼠RAW264.7 细胞致其M2 型巨噬细胞标志分子Arg-1 基因表达升高；在IL-4 诱导的M2 型细胞模型下，川续断皂苷Ⅵ能增加Arg-1基因表达。提示川续断皂苷Ⅵ能促进IL-4 诱导下小鼠RAW264.7细胞向M2型极化。M2型巨噬细胞参与组织修复，有研究表明细胞因子信号转导抑制蛋 白-2（suppressor of cytokine signaling protein-2，SOCS2）缺失的巨噬细胞向M1 极化［23］。SOCS2 是调节M2 极化的关键转录因子，可以促进巨噬细胞向M2 极化［24］。本研究发现川续断皂苷Ⅵ能促进IL-4诱导下小鼠RAW264.7 细胞高表达SOCS2 基因，提示川续断皂苷Ⅵ可能通过调节SOCS2 信号通路促进RAW264.7细胞向M2型极化。

综上所述，川续断皂苷Ⅵ可以抑制RAW264.7巨噬细胞向M1 型极化，同时促进其向M2 型极化。川续断皂苷Ⅵ可通过以上作用来调节M1/M2 型巨噬细胞极化发挥其抗炎免疫调节作用，但是川续断皂苷Ⅵ对M1/M2 型巨噬细胞极化的调节作用机制仍有待后续深入研究。