原发免疫性血小板减少症关键基因与通路的筛选及中药研究①

乌日图那顺 布仁巴图 （内蒙古民族大学附属医院，通辽028000）

原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一种获得性自身免疫性出血疾病，临床上多表现皮肤、黏膜和内脏出血等症状，主要病理特征为外周血小板减少、骨髓巨核细胞数正常或增多或伴有成熟障碍［1-3］。导致血小板减少的原因有很多，多数学者认为体液免疫异常导致B 淋巴细胞产生抗血小板自身抗体，引起血小板损伤，是血小板减少的主要原因［4］。也有学者认为ITP 患者血小板减少与血小板反应性CD4+T 细胞具有促进抗血小板自身抗体应答的活性，并参与ITP患者致病性抗血小板自身抗体产生有关［5］。ITP 还与某些基因的异常表达有关，表明存在更深层次的发病机制，有研究表明ITP 患儿Treg 细胞糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）表达下调，治疗改善后表达恢复正常［6］。但具体的致病机制尚不完全清楚。目前，ITP 的治疗集中于使用类固醇、免疫球蛋白、免疫抑制剂和脾切除术预防血小板破坏。然而，这些治疗方法伴有较大的副作用，如感染和出血［7］。中医药治疗ITP具有独特的优势，尚未发现显著的不良反应，中药本身历史悠久，临床应用经验丰富，是治疗ITP 的优先推荐用药，如血宝丸（由胡黄连、栀子、西红花、天然牛黄等14味药材配伍而成，具有清热解毒、凉血止血的功效，于2019年被内蒙古自治区药品监督管理局批准为院内制剂，编号：内药制字M180600017）。有学者采用数据挖掘发现补虚药、止血药、清热药对ITP 具有良好的疗效［8］。但具体哪些中药通过怎样的生物学途径发挥治疗作用还不是特别清楚。本研究拟通过生物信息学方法对GEO 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中的原始数据芯片进行miRNA 差异性分析，挖掘差异性表达显著的miRNA，并预测其潜在靶基因与信号通路，通过关键基因预测具有治疗ITP 作用的潜在中药，旨在揭示其可能的作用机制，为临床应用及实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 芯片数据的获得 以primary immune thrombocytopenia 为关键词，设置种属为homo sapiens，在GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm）中进行检索，获得GSE80401 基因表达谱，共包含16 例样品基因芯片数据，其中病例组10 例，对照组6 例。该片段平台为GPL18402（Agilent-046064 Unrestricted_Human_miRNA_V19.0_Microarray）。通过R 语言“Limmar”包比较对照组与ITP 组的差异miRNA，以调整P<0.05 及|logFC|≥1 为筛选差异miRNA 的标准，其中logFC≥1 代表表达上调，logFC≤-1 代表表达下调。使用pheatmap R 包对差异miRNA 进行热图绘制。在热图中，红色代表miRNA 在该样品中高表达，蓝色代表miRNA 在该样品中低表达。使用ggplot2 R包对差异miRNA 进行火山图绘制。在火山图中，红色代表上调miRNA，绿色代表下调miRNA。

1.2 ITP 靶点挖掘 GeneCards （htttp：//www.genecards.org）是一个能提供基因组、蛋白质组、转录、遗传和功能上所有已知预测的人类基因的综合数据库。以primary immune thrombocytopenia 或ITP 为关键词，通过GeneCards 数据库查询筛选，获得ITP 的相关治疗靶点。

1.3 miRNA 靶基因预测 通过miRTarBase（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）、miRDB（http：//mirdb.orhttp：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/g）、TargetScan human 8.0（http：//www.Targetscan.org）3 个靶基因数据库分别预测差异miRNA，对三者的预测结果绘制韦恩图，得到交集基因。将上述基因与1.2 中获取的ITP 基因交叉映射，得到映射靶基因。

1.4 蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建与Hub 基因的获取 将映射靶基因分别通过String 数据库（http：//string-db.org/）、Cytoscape软件的CytoHubba 插件、MCODE 插件进行PPI 分析（筛选标准：combined score>0.4）、网络分析（Cyto-Hubba 根据nodes 在网络中的属性进行排名，包含12 种拓扑分析方法，具有高degree 的蛋白更倾向于关键蛋白，以degree 对节点进行排名）、模块分析等方式综合筛选（Hub gene）基因，选择物种为homo sapiens。

1.5 基因本体论分析及KEGG 通路富集分析 对核心基因进行注释，通过DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）和OmicsBean（http：//www.omicsbean.cn/）数据库进行基因功能富集分析（GO 基因本体论）和KEGG 通路富集分析，GO 分析包含3 个方面：细胞组分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物学过程（biological process，BP）。

1.6 靶点对接及中药预测 将筛选出的核心基因与医学本体信息检索数据库Coremine Medical（http：//www.coremine.com/）相互映射，筛选出核心基因相关治疗中药，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异miRNA 基于GSE80401 的基因片段原始数据，以调整P<0.05 及|logFC|≥1 为筛选标准，共得到72个差异表达miRNA，上调miRNA 55个，下调miRNA有17个，见图1、图2。

图1 ITP患者与健康对照差异miRNA火山图Fig.1 Volcano plots of differential expressed miRNA between ITP patients and healthy controls

图2 差异miRNA热图分析Fig.2 Differential miRNA heat map analysis

2.2 PPI 网络构建与Hub 基因获取 在Genecards数据库通过分数>1 标准筛选，合并2 个关键词搜索的基因，共3 936 个靶点。使用miRDB、miRTar-Base、TargetScan 3个数据库分别预测差异miRNA的靶基因，取交集，共2 454 个靶基因。其中上调、下调靶基因各1 015 个，将上调和下调靶基因分别和Genecards 的ITP 靶点取交集，得到上调的映射靶基因235 个，下调的映射靶基因233 个。差异基因经去重后共422个。

将上调和下调靶基因导入String 数据库进行PPI 分析，使用Cytoscape 软件CytoHubba 对其 进一步分析，筛选关键基因，结果显示，上调基因Cyto-Hubba 分析后依据degree 排名前15 的关键基因为TP53、ACTB、KRAS、CCND1、HIF1A、CREB1、MAPK1、PIK3R1、GRB2、CD44、MAPK8、ACTG1、CDK2、CDKN1A和BCL2L1，使用Cytoscape 软件的MCODE模块对其进行分析后得到7 个重要模块；第1 个模块 主 要 包 括CD44、TCHP、CDK2、AURKA、SP1、YAP1、CREB1、ETS1、NR3C1、CDKN1A、MAPK1、LYN、BCL2L1、PIK3R1、MAPK8、MET、GRB2、CDKN1B、XIAP、CCND2、HNF4A、CCND3、CCND1共23 个基因。该模块主要与人T 细胞白血病病毒1 感染、PI3K-Akt 信号通路和FoXO 信号通路最相关。上调基因中CytoHubba 按degree 排名前15 和MCODE 第1 个模块得到的基因取交集，共得到10个基因：BCL2L1、CCND1、CD44、CDKN1A、CREB1、GRB2、MAPK1、MAPK8、PIK3R1和CDK2。

下调基因依据degree 排名前15 的关键基因为CTNNB1、GAPDH、PTEN、STAT3、VEGFA、MTOR、SMAD4、FoXO3、HSPA8、IGF1、FGF2、CAV1、SMAD2、TLR4和MET，MCODE 分析后得到4 个重要模块，第1 个 模 块 主 要 包 括TGFBR2、JAG1、E2F1、IGF1、SMAD2、BMP2、TLR4、SKP2、RB1、SMAD4、CYCS、CAV1、CDC25A、FGF2、NFE2L2、APP、IRS1、TGFβ2、GSK3β、VEGFA、MMP2和PPARA共22个基因。该模块主要与对缺氧的反应和伤口愈合生理学过程关系密切，和细胞周期通路最相关。下调基因中Cyto-Hubba按degree排名前15和MCODE第1个模块下的得到的基因取交集，共得到7 个基因：CAV1、FGF2、IGF1、SMAD2、SMAD4、TLR4和VEGFA。

2.3 核心基因GO分析和KEGG富集分析 将17个核心基因通过OmicsBean 数据库进行BP 分析，发现排名前10 的BP 是磷酸化修饰（protein phosphorylation）、细胞对有机物质反应（cellular response to organic substance）、有机物反应（Respense to organic substance）、细胞因子刺激（cellular response to cytokine stimulus）、伤口愈合（wound healing）、化学刺激（cellular response to chemical stimulus）、细胞因子（response to cytokine）、氮化合物（response to nitrogen compound）、对细胞因子刺激的反应（cellular response to growth factor stimulus）和非生物刺激（response to abiotic stimulus）（图3）。17 个核心基因可能参与细胞内囊泡（intracellular vesicle）、细胞质（cytosol）、细胞质小泡（cytoplasmic vesicle）、细胞连接（cell junction）、激活素反应因子复合物（activin responsive factor complex）、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物（cyclin-dependent protein kinase holoenzyme complex）、内膜系统（endomembrane system）、细胞内细胞器部分（intracellular organelle part）、细胞器部分（organelle part）和胞质部分（cytoplasmic part）组成（图4）。17 个核心基因主要涉及的MF 排名前10 的为高分子复合物结合（macromolecular complex binding）、蛋白结合（protein binding）、酶结合（enzyme binding）、转录因子结合（transcription factor binding）、蛋白复合体结合（protein complex binding）、分子功能调节器（molecular function regulator）、相同蛋白质结合（identical protein binding）、蛋白质异二聚活性（protein heterodimerization activity）、蛋白激酶结合（protein kinase binding）和激酶结合（kinase binding）（图5）。17 个核心基因主要涉及的通路排名前10 的为癌症中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、FoXO 信号通路（FoXO signaling pathway）、PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人T 细胞白血病病毒1 感染（Human T-cell leukemia virus 1 infection）、内分泌抵抗（endocrine resistance）、黏着斑（focal adhesion）、松弛素信号通路（relaxin signaling pathway）、慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia）、调节干细胞多能性的信号通路（signaling pathways regulating pluripotency of stem cells）（图6）。将上述BP、通路和蛋白构建网络，结果发现氮化合物、磷酸化修饰、细胞因子和化学刺激处于网络核心位置，涉及蛋白主要包括MAPK1、MAPK8和CDKN1A。

图3 ITP患者与健康对照差异基因的BP分析Fig.3 BP analysis of differential genes between ITP patients and healthy controls

图4 ITP患者与健康对照差异基因的CC分析Fig.4 CC analysis of differential genes between ITP patients and healthy controls

图5 ITP患者与健康对照差异基因的MF分析Fig.5 MF analysis of differential genes between ITP patients and healthy controlsl

图6 ITP患者与健康对照差异基因-通路-BP网络分析Fig.6 Differential gene-pathway-BP network analysis of ITP patients and healthy controls

2.4 核心靶点对接及中药预测 将17个基因映射到Coremine Medical 数据库，筛选治疗ITP 的潜在中药，结果显示TLR4映射的中药药味最多，其次为CCND1和VEGFA。在众多中药中，人参同时作用于17个靶点，赤芍、当归和蜂毒同时作用于11个靶点，眼镜蛇和补骨脂同时作用于9 个和8 个靶点，地黄和水牛角同时作用于7 个靶点，火麻仁同时作用于4 个靶点，菟丝子同时作用于3 个靶点，五灵脂同时作用于2 个靶点。提示上述药物具有多靶点防治ITP的潜能，见表1、表2。

表1 基于ITP关键靶点的中药预测结果Tab.1 Prediction results of traditional Chinese medicine based on ITP key targets

表2 ITP关键靶点相关中药频数统计表Tab.2 Statistical frequency of traditional Chinese medicine related to key targets of ITP

3 讨论

本研究通过提取GSE80401 的基因片段数据，研究对象为ITP 患者和健康对照的外周血。运用生物信息学方法分析，最终获得17 个治疗ITP 的关键基因，通过DAVID 6.8 功能注释聚类分析获得富集分数最高的为4.14，包括蛋白聚糖、FoXO 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、人T 细胞白血病病毒1 感染等，富集分析结果表明排名最前的BP是细胞迁移的正 向 调 节，涉 及 的 蛋 白 有TLR4、GRB2、FGF2、CAV1、CDKN1A、IGF1、MAPK1、VEGFA和PI3KR1。

Toll 样受体（Toll-like receptors，TLPs）是在免疫防御反应中发挥重要作用的受体蛋白，通过识别病原微生物、偶联信号传导途径，启动天然免疫和调节性免疫应答，并在天然免疫和获得性免疫中起桥梁作用［9］。本研究中has-miR-21-5p 表达下调，推测对应的TLR4 也表达下调，表明其病毒清除能力和免疫应答能力下降，和马利敏等［10］报道的TLR4 在慢性ITP患儿中表达下降的结果相一致。

生长因子受体结合蛋白2（growth factor receptor-bound protein 2，GRB2）是与活化的表皮生长因子受体EGFR 相关的衔接蛋白，GRB2在各种受体介导的信号传导途径中通过募集辅助蛋白发挥信号转导的作用［11］。研究报道，GRB2 在巨噬细胞的极化、吞噬功能、增殖和迁移等方面发挥重要作用，与人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）密切相关［12］。而ITP 发病机制之一就是血小板模糖蛋白特异性抗体介导的单核-巨噬细胞吞噬破坏血小板过多而引发［13］。本研究中has-miR-5196-5p 表达上调，推测对应的GRB2 也表达上调，推测ITP 患者GRB2 高表达通过某些细胞因子刺激酪氨酸磷酸化参与信号通路的调节作用，促进病毒的复制和扩散。成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）是一种旁分泌生长因子，正常生理状态下，FGF2以膜结合形式存在于基底膜和血管内皮细胞外基质中，在伤口愈合过程中，FGF2 表达上调，促进血管生成［14］。研究发现，FGF2与IL-17相互作用激活ERK1/2 通路，诱导炎症因子和趋化因子的高表达，促进了类风湿性关节炎的自身免疫反应过程［15］。本研究中hsa-miR-144-3p 表达下调，相应的FGF2表达下调，推测ITP 患者中血管生成和修复存在异常。小窝蛋白（Caveolin-1，CAV1）是平滑肌细胞（SMCs）中主要的CAV1 同种型，CAV1 缺乏导致SMCs中CAV1的丢失。CAV1可负向调节信号转导通路，如涉及TGF-β 受体1、一氧化氮合酶、蛋白激酶A、ERK1/2 和PI3K-AKT 的信号转导通路，或增强下游效应蛋白如IR、雌激素受体、蛋白质脂肪酶C 和蛋白质脂肪酶D［16-18］。本研究中，hsa-miR-106b-5p 表达下调，对应CAV1 表达下调，TGF-β 和NOS 等可能被激活，从而抑制自身反应性T 细胞和辅助T细胞的活化，促进ITP的发展。研究表明，ITP患者的TGF-β1 较健康组明显升高，与本研究的结果相吻合［19］。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（Cyclin-dependent kinase inhibitor 1，CDKN1A），具有最广泛细胞周期依赖性激酶抑制活性，可通过调控细胞周期的进展，广泛参与细胞增殖、分化等多种细胞功能的调节［20］。CDKNA1A是p53基因最重要的下游基因之一，是DNA 损伤后p53调控的细胞周期阻滞的主要调控元件。当ITP 患者细胞受到各种损伤后，p53 基因作为转录因子启动CNKN1A表达，CDKN1A表达上调，继而使细胞周期阻滞在G1期，为细胞在进入S 期前进行DNA 损伤修复赢得时间［21］。胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor 1，IGF1）是一类结构上类似胰岛素原的多肽，在神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞上表达，在细胞代谢、增殖、分化和凋亡中起作用［22］。体内几乎所有免疫细胞均存在IGF-1受体，对IGF-1的刺激产生反应［23］。研究表明，血清IGF1在血小板升高患者中有明显增高趋势，本研究中，hsa-miR-4649-3p 表达下调，ITP 患者的血小板减少，IGF1 的表达下调，与之前的研究结果相吻合［24］。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一种能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，MAPK1是MAP 激酶家族的成员之一，又称细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK），是多种生化信号的整合点，参与多种细胞过程，如增殖、分化、转录调控和发育。磷酸化后，可转位至细胞核，使核靶点磷酸化，这种蛋白作为一种转录抑制因子独立于其激酶活性［25］。本研究中，MAPK1表达上调，可能使ERK1、ERK2 级联信号通路激活，加快ITP 患者细胞的生长和分化。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用［26-27］。研究表明，ITP 患者血小板减少的原因可能和血管完整性受损和血管壁修复异常有关。本研究中hsa-miR-106b-5p 表达下调，相应的VEGFA 表达下调，提示ITP 患者血管内皮细胞存在损伤。和其他研究结果相吻合［28］。磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基alpha（phosphatidylinositol 3-kinase regulatory subunit alpha，PI3KR1），是PI3K 的 调 节 亚 基，PI3KR1 可 通 过PIK3CA 催化亚基相互作用维持PI3K 的低活性状态。PI3K 属于酯类的激酶，能磷酸化与膜相关的磷脂酸肌醇家族，在细胞的有丝分裂发生、细胞存活、分化和激活、细胞骨架的构型与重塑以及囊胞的运输发挥着重要的作用［29］。本研究中PI3KR1 表达上调，可能使酪氨酸激酶激活，介导和协助NF-κB 核转录，造成炎症细胞浸润、细胞因子和炎症介质的堆积，加速ITP的进程［30］。

IPT 的骨髓细胞形态学方面的病因是产血小板巨核细胞成熟障碍所致，与巨核细胞分化周期密切相关。因此细胞周期相关机制的研究是ITP 的研究重点，除上述蛋白以外，与细胞周期通路相关的蛋白还包括SMAD2、SMAD4、CCND1、CDK2 和CDKN1A 5个蛋白，也在ITP患者和健康对照组中存在表达差异，例如：周期素依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）是必需的脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶，位于磷酸受体c末端的碱性氨基酸。CDK2是CDK 酶家族的一员，是细胞G1/S 期转换过程中的重要调控因子［31］。本研究中hsa-miR-765表达上调，对应的CDK2 也相应表达上调，推测CDK2 可能和cyclin A 结合并激活复合物，维持G1后期pRb 的磷酸化，保证细胞顺利通过G1进入S期［32］。

SMAD 蛋白是指参与TGF-β 细胞内信号传导的信号蛋白，它是TGF-β 受体作用的直接底物，是将配体与受体作用的信号由胞浆传导至细胞核的中介分子。SMAD2 蛋白是受体调节型的SMAD 蛋白，是TGF-β 信号转导所必需的蛋白，TGF-β 诱导SMAD2 的核转位，与相应的靶基因相结合，其反过来调节TGF-β 应答基因表达［33］。而SMAD4 是共同调节型SMAD 蛋白，具有稳定SMAD 低聚体的结构，使SMAD 复合物保持有效的转录活性。SMAD4 是TGF-β 信号通路的核心转导，只有在SMAD4 存在的情况下，TGF-β 信号才能转移到细胞核中调控转录［34］。在 本 研 究 中，hsa-miR-1228-3p 和hsa-miR-106b-5p 表达下调，对应的SMAD2 和SMAD4 下调，推测ITP 患者中存在代偿效应，通过降低SMAD2 和SMAD4 表达，影响TGF-β 的信号转导起到延缓ITP进程的作用［35］。

基于关键基因预测得到的中药可能具有防治ITP 的潜在功效。结合频数统计，基于功能分类的靶点-中药网络关系、药物归经及临床应用的实际情况，首先对结果中的148 频次共计12 味中药进行分类分析。结果发现，所预测中药主要分为以下3类：①用于瘀血内阻，久病不愈，皮肤青紫斑点，胸闷胁痛。治疗以理气活血、化瘀止血通络为主，对应的中药有当归、赤芍、五灵脂、蜂毒和眼镜蛇；②用于血热妄行，紫癜色鲜红而密集的，治疗以凉血化斑为主，对应的中药有生地黄、水牛角和金鸡纳皮；③用于气不摄血，紫癜色淡红而稀疏，时隐时现，伴有体倦乏力、神疲懒言等，治疗以补脾益肺、温肾助阳为主，对应中药有人参、补骨脂、菟丝子和火麻仁。

中医认为ITP 的内因是由于疲劳过度、情志不畅、饮食不节制等损伤心、肝、脾和肾，导致脏腑功能失调或耗气伤阴而出血；外内是由于各种因素损伤脉络而导致出血。主要的病理因素包括火、虚和瘀3 种，临床上主要分为热盛破血证、气不摄血证、阴虚火旺证、瘀血内阻证4 个证型［36］。上述预测的中药正好对应其中3 个证型，表明预测的结果较为准确。上述中药大部分也经常用于临床治疗ITP，且效果显著。如疏风凉血补肾方其中包括生地黄、水牛角、赤芍、补骨脂4 味中药［37］；益气养血方包括生地黄、当归、菟丝子3味中药用来治疗难治性免疫血小板减少症［38］；益气摄血方包括人参和当归2 味药，在临床上主要用于治疗气不摄血型ITP，疗效确切［39］。中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，本研究结果中的人参、赤芍、当归、生地黄等均通过多靶点发挥治疗ITP 的作用。如人参通过调节CREB1、MAPK1、PIK3R1、GRB2、CD44、MAPK8、TLR4、CDK2、CDKN1A、VEGFA、SMAD4、FGF2、IGF1 CAV1、SMAD2、BCL2L1、CCND1等17 个靶点发挥防治ITP 的作用。具体哪些成分作用于上述靶点是进一步研究的重点。

本文的前期研究“糖皮质激素诱导巨噬细胞RAW264.7的炎症免疫和细胞活性试验”表明，治疗ITP 的潜在中药地黄的有效成分之一桃叶珊瑚苷协同水飞蓟宾对MIF基因的高表达和巨噬细胞有激活活性作用。从而激活巨噬细胞对引发ITP 抗原的吞噬，达到治疗的作用。综上所述，本研究通过生信分析初步预测ITP 致病的关键基因，筛选了具有防治作用的中药，并揭示作用的潜在靶点及BP，相关结果有待后续通过实验及临床研究加以验证，以期为相关中药新药开发提供依据。