探讨黄芪甲苷对桥本甲状腺炎大鼠甲状腺细胞凋亡及RhoA/ROCK2通路的影响①

刘光霞 陈 芳 高 伟 王晓雅 卢亚敏 侯 瞻 赵连春

（河北省人民医院核医学科 ，石家庄050051）

桥本甲状腺炎（hashimoto thyroiditis，HT）是一种慢性炎症性疾病，属于自身免疫性疾病范畴，患者免疫系统异常激活，引发大量淋巴细胞浸润甲状腺组织，导致甲状腺细胞凋亡，造成甲状腺功能减退［1-2］。免疫细胞的活化，可促使炎症细胞因子过量表达释放，引发强烈的免疫炎症反应，导致甲状腺组织损伤，是HT 的主要致病机制。因此，调控免疫控制炎症是防治HT 的关键［3-4］。黄芪甲苷是中药黄芪的重要活性成分，可抑制核苷酸结合寡聚化结构 域 样 受 体 蛋 白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体活化，降低促炎因子IL-1β及TNF-α表达，减轻炎症，改善关节软骨损伤，还可抑制丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号激活，减少脂多糖诱导的炎症相关因子产生，发挥显著的抗炎作用，因而可推测黄芪甲苷可能通过抑制炎症治疗HT［5-6］。Ras 同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）/Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2（Rho-associated coiled-coil containing kinase 2，ROCK2）是重要的炎症调控信号，参与介导脑卒中、阿尔茨海默病等炎症性疾病的发生及进展过程，抑制RhoA/ROCK 信号，可显著减少缺血再灌注诱导的促炎因子合成分泌，阻碍炎症发生发展，降低氧化应激水平，抑制神经细胞凋亡，改善认知功能，发挥明显的神经保护作用［7-9］，因而RhoA/ROCK 信号能作为重要的HT 潜在治疗靶点。本文通过构建HT 大鼠模型，基于RhoA/ROCK2通路探讨黄芪甲苷对其甲状腺细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD 雄性大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011，SPF 级，体质量180～220 g，严格参照动物饲养规范分笼饲养于以岭医药研究院动物房，温度：22～25 ℃，湿度：47%～55%，光照：12 h/12 h 明暗循环。本实验经河北省人民医院伦理委员会审批（202160）。

1.1.2 主要试剂及仪器 黄芪甲苷（纯度≥98%，84687-43-4）购自南京春秋生物工程有限公司；Rhosin（HY-12646）购自美国Med Chem Express 公司；甲状腺球蛋白（源于猪，QA052105）、无水碘化钠（AQ032244）购自安徽酷尔生物工程有限公司；弗氏不完全佐剂（F5506）、弗氏完全佐剂（F5881）购自美国Sigma 公司；抗甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）ELISA 试剂盒（m1048720）、抗甲状腺球蛋白抗体（TGAb） ELISA 试剂盒（m1003044）购自上海酶联生物科技有限公司；原位末端标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）细胞凋亡检测试剂盒（E607172-0001）、苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染 色 试 剂 盒（E607318-0200）、二 喹 啉 甲 酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白质定量检测试剂盒（C503021-0500）、大 鼠 IL-17 ELISA 试 剂 盒（D731078-0096）、放射免疫沉淀测定（radio-immune precipitation assay，RIPA）裂解液（C500005-0050）购自上海生工生物工程股份有限公司；大鼠IL-1β 测试盒（H002）、大鼠IL-6测试盒（H007）购自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源anti-RhoA 抗体（ab187027）、羊抗兔二抗（ab150077）、兔源anti-甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一 抗（ab181602）、兔 源anti-ROCK2 抗体（ab125025）购自美国Abcam 公司；ECL发光试剂盒（PE0010）购自北京索莱宝生物科技有限公司。

M200 PRO 酶标仪购自TECAN 公司（瑞士）；EM UC7 超薄切片机、EG1150 分体式包埋机购自Leica公司（德国）；HPIAS 1000彩色病理图文分析系统购自武汉同济医科大学千屏影像工程公司（中国）；Axiovert 200 光学显微镜购自ZEISS 公司（德国）；1658033 垂直电泳转印系统购自Bio-Rad 公司（美国）；GIS-500 型凝胶成像仪购自杭州米欧仪器有限公司（中国）。

1.2 方法

1.2.1 制备HT 模型大鼠及分组给药 参照文献［10］方法并加以改良制备HT 模型：将甲状腺球蛋白溶于0.9%NaCl 溶液，并将其与等体积完全弗氏佐剂混合，置于玻璃杯中，以小型搅拌机充分搅拌乳化后制成油包水制剂，因不稳定性用时制备，所得油包水制剂中甲状腺球蛋白浓度为2 mg/ml，于大鼠足垫和尾根皮下注射100 μg甲状腺球蛋白（50 μl油包水制剂）进行初次免疫，1 周后加强免疫，即第2 周将甲状腺球蛋白溶液与等体积不完全弗氏佐剂混合，制成油包水制剂，使甲状腺球蛋白浓度为2 mg/ml，以 同 样 方 法 注 射100 μg 甲 状 腺 球 蛋 白（50 μl 油包水制剂），每周注射1 次，连续注射6 次，第2 周至第7 周，大鼠以高碘水（0.64 g/L 碘化钠）喂养，在第8周检测大鼠血清TGAb、TPOAb水平，当血清TGAb、TPOAb 含量上升，提示模型制备成功，随机分为模型组、黄芪甲苷组、Rhosin 组、黄芪甲苷+Rhosin组，每组12只，另选出12只SD大鼠，正常饮水，并以同样方法皮下注射等剂量生理盐水，作为对照组。

将黄芪甲苷与Rhosin 溶于0.9%NaCl 溶液，制得8 mg/ml 黄芪甲苷药液（混悬液）、4 mg/ml Rhosin药液（混悬液）［11-12］，黄芪甲苷+Rhosin 组大鼠以10 ml/kg剂量灌胃黄芪甲苷药液，同时以10 ml/kg剂量腹腔注射Rhosin药液；黄芪甲苷组大鼠以10 ml/kg剂量灌胃黄芪甲苷药液，同时以10 ml/kg 剂量腹腔注射0.9%NaCl 溶液；Rhosin 组大鼠以10 ml/kg 剂量灌胃0.9%NaCl溶液，同时以10 ml/kg剂量腹腔注射Rhosin 药液；对照组、模型组大鼠以10 ml/kg 剂量灌胃0.9%NaCl 溶液，同时以10 ml/kg 剂量腹腔注射0.9%NaCl溶液，每天给药干预1次，持续21 d。

1.2.2 收集标本 药物干预结束后24 h，将大鼠置于乙醚中麻醉，切开颈部，以2 ml 注射器刺入颈总动脉，吸出1.6 ml血液，转入离心管，4 ℃离心10 min，将上清置于-80 ℃备用。处死大鼠，剥离出甲状腺，剪下约0.4 g 组织置于液氮备用。剩余甲状腺组织漂洗后，以仪器脱水后，置于二甲苯中透明，再以EG1150 分体式包埋机及EM UC7 超薄切片机依次进行包埋、切片。

1.2.3 检测大鼠甲状腺组织病理形态、甲状腺细胞凋亡率 将1.2.2中完整的组织切片置于二甲苯中脱蜡，在水化后分别选出3 张切片做HE、TUNEL染色，经同样方法脱水、透明后，置于光学显微镜下观察着色情况，观察甲状腺组织病理形态，采用HPIAS 1000 彩色病理图文分析软件得出甲状腺细胞凋亡率。

1.2.4 检测大鼠血清TGAb、TPOAb、IL-6、IL-17、IL-1β 含量 取出1.2.2 制备的血清，置于冰水浴中解冻，采用ELISA 实验测定各组大鼠血清TGAb、TPOAb、IL-6、IL-17、IL-1β 含量，具体步骤按照其各自试剂盒说明书指导进行：包被微孔板后封闭，依次加入待测样品和酶标抗体孵育，接着加入底物液显色后终止反应，以酶标仪测出各孔吸光度后计算各因子含量。

1.2.5 检测各组大鼠甲状腺组织RhoA/ROCK2 通路蛋白表达 取出1.2.2 液氮中的甲状腺组织，加入RIPA 裂解液，匀浆后4 ℃离心20 min，采用试剂盒通过BCA 法测出上清中总蛋白浓度，调至各组浓度相等后，100 ℃煮沸变性，取20 μl 各组样品液以电泳将蛋白分离开，湿转将其移至硝酸纤维素膜上，通过孵育5%脱脂奶粉封闭后，将目的蛋白RhoA、ROCK2、GAPDH 自膜上裁下，孵育一抗、洗膜、孵育二抗、洗膜、显色、拍照，通过Quantity One软件定量各蛋白条带灰度值，获得各组蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠血清TGAb、TPOAb 水平检测结果与对照组相比，模型组大鼠血清TGAb、TPOAb 水平明显升高（P<0.05）；与模型组相比，黄芪甲苷组、Rhosin 组大鼠血清TGAb、TPOAb 水平均降低（P<0.05）；与黄芪甲苷组、Rhosin组分别相比，黄芪甲苷+Rhosin 组大鼠血清TGAb、TPOAb 水平均降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清TGAb、TPOAb水平（±s，n=12）Tab.1 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group （±s， n=12）

表1 各组大鼠血清TGAb、TPOAb水平（±s，n=12）Tab.1 Serum TGAb and TPOAb levels of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

TPOAb/（U·ml-1）4.58±0.86 15.29±2.731）9.31±2.192）9.37±2.252）4.63±1.023）4）Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin TGAb/（U·ml-1）5.63±1.02 18.47±3.311）12.03±2.082）12.10±2.052）5.69±1.303）4）

2.2 各组大鼠甲状腺组织病理形态检测结果 对照组大鼠甲状腺组织形态结构正常，完好，无损伤；模型组大鼠甲状腺滤泡结构异常，部分萎缩或消失，排列紊乱，周围存在炎症细胞浸润，甲状腺组织有明显病理损伤；黄芪甲苷组、Rhosin组大鼠甲状腺组织上述病理损伤均减轻；黄芪甲苷+Rhosin 组大鼠甲状腺组织上述病理损伤减轻程度强于黄芪甲苷组、Rhosin组。见图1。

图1 HE染色观察各组大鼠甲状腺组织病理形态（×200）Fig.1 Pathological morphology of thyroid tissue of rats in each group was observed by HE staining （×200）

2.3 各组大鼠甲状腺细胞凋亡检测结果 与对照组相比，模型组大鼠甲状腺细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与模型组相比，黄芪甲苷组、Rhosin 组大鼠甲状腺细胞凋亡率均降低（P<0.05）；与黄芪甲苷组、Rhosin 组分别相比，黄芪甲苷+Rhosin 组大鼠甲状腺细胞凋亡率均降低（P<0.05）。见图2、表2。

图2 TUNEL染色检测各组大鼠甲状腺细胞凋亡（×200）Fig.2 Apoptosis of thyroid cells in each group was detected by TUNEL staining （×200）

表2 各组大鼠甲状腺细胞凋亡率（±s，n=12）Tab.2 Apoptosis rate of thyroid cells in each group （±s，n=12）

表2 各组大鼠甲状腺细胞凋亡率（±s，n=12）Tab.2 Apoptosis rate of thyroid cells in each group （±s，n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with Model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

Apoptosis rate/%1.05±0.27 38.94±5.231）19.52±4.842）19.66±4.652）1.31±0.323）4）Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin

2.4 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量检测结果 与对照组相比，模型组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量明显升高（P<0.05）；与模型组相比，黄芪甲苷组、Rhosin组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量均降低（P<0.05）；与黄芪甲苷组、Rhosin 组分别相比，黄芪甲苷+Rhosin 组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量均降低（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量（±s，n=12）Tab.3 Serum contents of inflammatory factors IL-6，IL-17 and IL-1β of rats in each group （±s， n=12）

表3 各组大鼠血清炎症因子IL-6、IL-17、IL-1β 含量（±s，n=12）Tab.3 Serum contents of inflammatory factors IL-6，IL-17 and IL-1β of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with Model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin IL-6/（pg·ml-1）54.33±5.62 185.04±23.121）120.02±18.402）120.29±20.562）IL-17/（pg·ml-1）9.75±1.06 41.39±4.181）21.31±3.342）21.42±3.422）IL-1β/（ng·ml-1）0.22±0.03 1.04±0.141）0.67±0.112）0.69±0.132）55.02±7.493）4）10.02±1.133）4）0.24±0.063）4）

2.5 各组大鼠甲状腺组织RhoA/ROCK2 通路蛋白表达检测结果 与对照组相比，模型组大鼠甲状腺组织RhoA、ROCK2蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组相比，黄芪甲苷组、Rhosin组大鼠甲状腺组织RhoA、ROCK2 蛋白表达均降低（P<0.05）；与黄芪甲苷组、Rhosin 组分别相比，黄芪甲苷+Rhosin 组大鼠甲状腺组织RhoA、ROCK2 蛋白表达均降低（P<0.05）。见图3、表4。

图3 Western blot 检测各组大鼠甲状腺组织RhoA/ROCK2通路蛋白表达Fig.3 Expressions of RhoA/ROCK2 pathway protein in thyroid tissues of rats in each group detected by Western blot

表4 各组大鼠甲状腺组织RhoA/ROCK2 通路相关蛋白相对表达（±s，n=12）Tab.4 Relative expressions of RhoA/ROCK2 pathway related proteins in thyroid tissue of rats in each group （±s， n=12）

表4 各组大鼠甲状腺组织RhoA/ROCK2 通路相关蛋白相对表达（±s，n=12）Tab.4 Relative expressions of RhoA/ROCK2 pathway related proteins in thyroid tissue of rats in each group （±s， n=12）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with Model group， 2）P<0.05； compared with Astragaloside Ⅳ group， 3）P<0.05； compared with Rhosin group， 4）P<0.05.

ROCK2/GAPDH 0.18±0.04 1.79±0.321）0.96±0.142）0.98±0.182）0.20±0.063）4）Groups Control Model Astragaloside ⅣRhosin Astragaloside Ⅳ+Rhosin RhoA/GAPDH 0.43±0.07 1.65±0.211）1.02±0.172）1.04±0.162）0.45±0.113）4）

3 讨论

HT 以TPOAb、TGAb 表达升高为主要特征，近年来，随着饮食结构的变化，发病率有一定升高，且起病隐匿，容易误诊，目前尚无有效的治愈手段，免疫疗法、甲状腺激素、糖皮质激素等是临床主要治疗药物，但长期应用副作用明显，因而探寻更安全有效的药物对HT 的临床治疗意义重大［13-14］。本文以高碘饮水联合皮下注射甲状腺球蛋白的方法诱导HT 大鼠模型，结果显示，造模大鼠免疫系统异常激活，血清炎症因子IL-6、IL-17及IL-1β 含量明显升高，引发强烈的炎症反应，损伤甲状腺组织，导致甲状腺细胞凋亡、甲状腺滤泡结构异常、部分萎缩或消失、排列紊乱、炎症细胞浸润甲状腺组织、促使TGAb、TPOAb水平升高，揭示HT模型构建成功。

免疫炎症反应引发的甲状腺组织损伤及甲状腺细胞凋亡是HT 的主要病理基础，抑制炎症发生及进展是防治HT 的有效策略［15-16］。黄芪甲苷是一种天然的抗炎化合物，可抑制炎症因子IL-1β 和IL-17 表达释放，阻止炎症产生及进展，改善系膜增生性肾小球肾炎小鼠肾功能，还可通过抑制炎症提高肠道黏膜屏障功能，进而改善溃疡性结肠炎大鼠症状［17-18］，本文以黄芪甲苷处理HT 大鼠，可降低血清炎症细胞因子IL-6、IL-17及IL-1β 合成分泌，抑制炎症，减少甲状腺细胞凋亡，减轻甲状腺组织炎症损伤，表明黄芪甲苷可抑制甲状腺细胞凋亡，改善HT 大鼠甲状腺组织病理损伤，揭示黄芪甲苷对HT大鼠具有较好的治疗功效，在HT 的临床治疗中具有很好的发展前景。

Rho/ROCK 信号参与调控细胞损伤、凋亡及免疫炎症等多种病理生理过程，下调RhoA、ROCK2 表达，可降低IL-1β、TNF-α、IL-6 和IL-8 等炎症细胞因子表达，阻碍炎症发生发展，抑制细胞凋亡，减轻阿尔茨海默病大鼠脑组织损伤，延缓其病情进展［19-20］，因而抑制Rho/ROCK 信号激活可能是黄芪甲苷治疗HT 的作用机制。本文结果显示，HT 模型大鼠甲状腺组织RhoA 与ROCK2蛋白表达水平升高，RhoA 抑制剂降低HT 大鼠甲状腺组织RhoA 与ROCK2 蛋白表达，可减轻其甲状腺组织损伤，抑制炎症，降低甲状腺细胞凋亡率，表明Rho/ROCK 信号参与介导HT的致病过程，本研究结果显示黄芪甲苷可降低HT大鼠甲状腺组织RhoA 与ROCK2 蛋白表达水平，且与Rhosin 联合应用时，可增强黄芪甲苷对HT 大鼠的治疗作用，表明黄芪甲苷抑制甲状腺细胞凋亡，改善HT 大鼠甲状腺组织炎症损伤，可能是通过下调RhoA/ROCK2通路表达实现的。

综上所述，黄芪甲苷可能通过抑制RhoA、ROCK2 蛋白表达，阻碍免疫炎症产生及进展，减轻HT 大鼠甲状腺组织损伤，降低甲状腺细胞凋亡率，改善大鼠临床症状，抑制RhoA/ROCK2 激活可能是其药理机制，为黄芪甲苷在HT 临床治疗上的应用提供了科学依据，但本文对其药理机制的探讨还存在一定不足，后续会通过恢复实验进行对照验证，进而深入阐述黄芪甲苷治疗HT的作用机制。