环孢素A减轻急性胰腺炎模型小鼠心脏损伤的机制研究①

吴 童 高雪飞 贾迎丽 杨 静 （唐山市工人医院内科，唐山 063000）

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）是一种不可预测的威胁生命的炎症性疾病，常伴有严重的全身炎症反应，导致多器官功能障碍［1］。每个患者的预后取决于AP 的严重程度，最严重型通常伴有多器官损伤，病死率为15%～30%［2］。目前研究表明，促炎症细胞因子通过驱动炎症反应在AP 相关并发症中起着关键作用［3］。因此，更好地了解AP 的炎症调节途径对于发现新的治疗靶点是必要的。不同类型免疫细胞介导的抗炎和促炎免疫反应不平衡参与AP 病理生理学过程［1］。巨噬细胞在AP 损伤过程中起着至关重要的作用［4］。根据组织微环境中存在的刺激，巨噬细胞可分为典型激活的M1 型和交替激活的M2 型［4］。M1 表型巨噬细胞分泌促炎介质IL-6、IL-1β、TNF-α和活性氮、氧等促炎因子，具有较强的杀微生物作用。M2 表型巨噬细胞通过产生抗炎介质，如IL-10 和IL-4，参与组织重塑［5］。M2 型巨噬细胞在化解炎症中起着积极作用，这是AP 治疗所必需的。因此，调节巨噬细胞极化平衡可能是AP治疗的一个有前途的策略。环孢素A（Cyclosporin A，CSA）是一种有效的免疫抑制药物，主要抑制钙调神经磷酸酶和钙调神经磷酸酶依赖的转录因子［6］。通过这种抑制作用，CSA阻断T细胞产生NFAT依赖性细胞因子，如IL-2，并抑制包括辅助性T（Th）细胞在内的效应T 细胞激活和功能［6］。最近研究表明CSA对系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、脊柱关节炎等炎症性疾病具有有益的影响，同时能降低心血管疾病的发生风险［7］。因此，CSA 可有效治疗炎症性疾病。然而，它在调节巨噬细胞分化中的作用仍不清楚。鉴于上述发现，本研究旨在证明CSA 是否通过调节巨噬细胞极化影响AP 的炎症反应，从而保护AP小鼠及相关心脏损伤。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性C57BL/6J 小鼠，上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证：SCXK（沪）2018-0004。体质量22～25 g，6～8 周龄，安置在12 h/12 h明暗循环、无特定病原体环境中，自由饮用食物和水。

1.1.2 主要试剂与仪器 RAW264.7细胞（中国典型培养物保藏中心）；CSA（美国Sigma-Aldrich 公司）；缓冲液（美国BD Biosciences 公司）；FcR 阻断试剂（美国Miltenyi公司）；固定/渗透缓冲液（南京福麦斯生物技术有限公司）；L-精氨酸（北京Solarbio 公司）；CD206（美国Biolegend 公司）；血清肌酸激酶同工酶（上海卧宏生物科技有限公司）；乳酸脱氢酶（南京建城生物工程研究所）；酶联免疫吸附试验试剂盒（北京英柏生物科技公司）；TUNEL 检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；cDNA 合成试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa 公司）；BCA 蛋白检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；PVDF 膜（美国Millipore Corp 公司）；Aperio S2 Leica 生物系统显微镜（德国Leica 公司）；p-STAT6、GAPDH（美国Abcam公司）；ABI 7500 PCR 系统（美国Life Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 培养RAW264.7 细胞 将RAW264.7 细胞置于含10%胎牛血清（FBS）、1%双抗的DMEM 培养基中，于37 ℃、含5%CO2细胞培养箱中培养，每2 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 流式细胞术 将RAW264.7 细胞接种于6 孔板中，用0、5、10、20 nmol/L CSA 刺激24 h，然后将细胞密度调整为2.5×106个/ml，用200 μl 悬浮液检测M2标志物。用AF647 CD206或PEcy7 CD23抗体标记M2 标志物。极化分析心脏组织中巨噬细胞，将组织碎块置于0.1%Ⅳ型胶原酶溶液中孵育40 min，经70 μm 滤网过滤。取上清液300 g 离心5 min，弃上清，加入红细胞裂解液冰上孵育15 min，300 g 离心5 min，弃上清经200 目滤器过筛，细胞计数，再悬浮在染色缓冲液中。随后，加入FcR阻断试剂以提高抗体的特异性。细胞首先用表面标志物（F4/80）染色，用固定/渗透缓冲液固定和渗透，然后用FITC 偶联的CD11c（M1 标志）和APC 偶联的CD206（M2标志）染色，通过流式细胞仪进行分析。

1.2.3 AP模型建立 为研究CSA在AP中的作用，将雄性C57BL/6J 小鼠随机分为3 组（n=15），即对照组、AP 模型组和AP+CSA 组。参照文献［8］方法，对AP 组和AP+CSA 组小鼠腹腔注射L-精氨酸建立AP模型。L-精氨酸溶解在生理盐水中，并在注射前将pH 调节至7.0。小鼠以4 g/kg 剂量腹腔注射2 次L-精氨酸，每次注射间隔1 h。第1次注射后，所有小鼠可以自由获得食物和水。第2次注射L-精氨酸指定时间点为0。对于CSA治疗，在首次注射L-精氨酸前30 min，小鼠皮下注射20 mg/kg CSA（溶于橄榄油）。AP 诱导24 h 后，在戊巴比妥钠全麻下经眼眶静脉丛出血法采集血样于离心管静置。处死小鼠，将每只小鼠的胰腺、心脏组织用10%甲醛固定，进行病理学检查，同时将血样在3 000 g 下离心10 min。将血清置于-80 ℃冰箱储存备用。

1.2.4 小鼠血清胰腺、心肌损伤指标测定 用生化分析仪测定AP 诱导24 h 后血清肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶水平。采用ELISA 试剂盒检测肌钙蛋白（cTnT）、TNF-α、血清淀粉酶、脂肪酶水平。

1.2.5 组织病理学检查及免疫组化分析 AP诱导24 h 后处死小鼠。立即采集胰腺和心脏组织，用多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE 染色，在Aperio S2 Leica 生物系统显微镜下检查组织病理变化。采用TUNEL检测试剂盒检测组织切片中细胞凋亡。

1.2.6 RNA 提取与定量实时PCR 分析 用Trizol试剂从巨噬细胞裂解物和小鼠心脏中分离总RNA，并使用cDNA 合成试剂盒在37 ℃下反转录15 min。cDNA 采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和ABI 7500 PCR 系统进行实时PCR。使用2-ΔΔCt方法计算靶基因相对表达。目标基因序列见表1。

表1 目标基因序列Tab.1 Target gene sequence

1.2.7 细胞热位移分析（CETSA） 根据文献［9］进行CETSA。采用激酶缓冲液溶解收集的巨噬细胞，12 000 g 离心20 min，取上清液。巨噬细胞裂解液分为DMSO 组和20 nmol/L CSA 组。将各组分为7 等份，分别在46、50、54、58、62、66、70 ℃下热处理3 min，然后将DMSO 组和20 nmol/L CSA 组快速转移到冰上，用低温离心机在1 2000 g 离心10 min，取上清液，加入负载缓冲液，CETSA分析。

1.2.8 免疫印迹分析 收集细胞，通过裂解缓冲液裂解30 min，BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度，10%SDS-PAGE 分离，电泳转移到PVDF 膜上。在室温下用3%BSA封闭细胞膜1 h，4 ℃下用相应抗体：PKM2（1∶4 000 稀释）、HIF1α（1∶1 000 稀释）、p-STAT1（1∶1 000 稀释）、p-STAT6（1∶2 000 稀释）和GAPDH（1∶5 000 稀释）在4 ℃下孵育过夜，次日用HRP 偶联的二抗孵育1 h。用增强化学发光系统观察蛋白条带。通过GAPDH 免疫印迹法验证样品的等载量。用图像测量软件对谱带强度进行量化。

2 结果

2.1 CSA对RAW264.7细胞M2极化的影响 为了探讨CSA 对M2 极化的影响，用不同剂量的CSA（0、5、10 和20 nmol/L）刺激RAW264.7 细胞24 h。然后收集细胞并对M2 表型的CD206 和CD23 标志物进行染色。流式细胞术数据显示，M2标志物标志的巨噬细胞数量以剂量依赖性的方式增加（图1）。此外，还检测了M1 标志物一氧化氮合酶（iNOS）的转录水平。结果显示在CSA 刺激的细胞中iNOS mRNA表达减少（图2）。

图1 CSA对RAW264.7细胞M2极化的影响Fig.1 Effects of CSA on M2 polarization in RAW264.7 cells

图2 RT-qPCR检测iNOS mRNA水平Fig.2 mRNA levels of iNOS determined by RT-qPCR

2.2 CSA可改善实验性AP胰腺损伤 评估CSA对L-精氨酸诱导的AP 的影响，结果表明，AP 组24 h病死率为33.3%（5/15）。对照组、AP+CSA组小鼠均存活24 h。AP 组胰腺组织出现明显的组织病理学改变，包括水肿、出血和腺泡细胞变性，组织病理学评分明显高于对照组，CSA预处理显著改善胰腺结构，降低胰腺组织病理学评分（图3A、B）。此外，还评估了血清淀粉酶、脂肪酶和胰腺TNF-α变化。AP显著提高了血清淀粉酶和脂肪酶水平以及胰腺TNF-α水平，表明AP小鼠模型胰腺损伤严重。CSA预处理显著降低了参数的水平（P<0.05，图3C～E）。结果表明CSA给药对L-精氨酸诱导的AP有保护作用。

图3 CSA改善实验性AP损伤（×200）Fig.3 CSA ameliorate pancreatic damage in experimental AP （×200）

2.3 CSA 减轻AP 模型小鼠心脏损伤 HE 染色显示心肌损伤的病理特征，AP 组心肌纤维坏死、炎症细胞浸润、出血和梗死区结构破坏，CSA预处理显著减轻心肌损伤程度（图4A）。此外，AP 模型组显著提高了血清CK-MB、LDH 和cTnT 水平，表明AP 小鼠模型心肌损伤严重，CSA 预处理显著降低了这些参数的水平（P<0.05，图4B～D）。与这些结果一致，AP 模型组心肌TUNEL 阳性细胞多于对照组，CSA预处理显著减少TUNEL 阳性细胞数量（图4E）。表明CSA对AP模型小鼠的心脏损伤具有保护作用。

图4 CSA减轻AP模型小鼠心脏损伤Fig.4 CSA attenuates cardiac injury in AP model mice

2.4 CSA抑制AP模型小鼠的心肌炎症反应 通过检测心肌组织中炎症物质的表达水平，探讨CSA 对AP模型小鼠的心肌炎症反应的影响。如图5A、B所示，与对照组相比，AP 模型组中心肌炎症细胞因子IL-1β 和iNOS mRNA 表达显著增加，CSA 预处理显著抑制了IL-1β 和iNOS mRNA 表达。M1 表型巨噬细胞分泌炎症细胞因子，如前所述，CSA在体外调节巨噬细胞极化，进一步检测心肌巨噬细胞功能。CD11c+F4/80+为M1 表型，CD206+F4/80+为M2 表型。流式细胞术分析显示，CSA预处理显著降低AP诱导的心肌巨噬细胞中CD11c+F4/80+比例，提高CD206+F4/80+比例（图5C～E）。

图5 CSA抑制AP小鼠心肌炎症反应Fig.5 CSA inhibits myocardial inflammatory response in AP mice

2.5 PKM2 作为CSA 的潜在靶点 本研究进一步考察CSA 是否能抑制LPS 诱导的PKM2 激活并防止巨噬细胞炎症。结果表明，LPS+CSA 处理显著抑制LPS 诱导PKM2 表达（图6A）。此外，PKM2 还可以通过蛋白质-蛋白质相互作用发挥生物学功能。20 nmol/L CSA+LPS 显著抑制HIF1α 表达，同时伴随着巨噬细胞中p-STAT1 表达降低和p-STAT6 表达增加（图6A）。为了验证CSA 与PKM2 靶蛋白的结合，使用CETSA 验证目标。当靶蛋白与小分子结合时，结构向低能高稳定性方向变化，耐高温能力增强。如图6B 所示，在CSA 处理的细胞裂解液中，PKM2对高温有较强的耐受性，在高温下PKM2 条带强度较DMSO组增强，说明PKM2是CSA的靶标。

图6 PKM2作为CSA的潜在目标Fig.6 PKM2 serves as a potential target for CSA

3 讨论

AP 是一种致命的临床疾病，其特点为进展迅速，目前没有特效的方法可以阻止胰腺坏死的发生与发展，通常伴有多器官损伤，一旦发病其病死率高达50%～60%［1］。因此，通过改变过度炎症反应是一种有效的治疗手段［10］。大量研究发现，各种炎症介质诱导的炎症反应在AP 模型小鼠诱发的多器官损伤中起重要作用［2］。在较多的炎症模型中，有研究发现，用L-精氨酸制备AP模型，24 h时到高峰，均与众多临床上分析该疾病的结果近似，因此本实验采用L-精氨酸制备AP 模型小鼠作为研究对象［11］。CSA在多种炎症性疾病方面有较好的治疗作用。该研究采用CSA 作为预防给药处理。为了进一步研究，本研究分析了CSA 在AP 模型小鼠合并心脏损伤中的潜在作用，结果表明，CSA 减轻了胰腺损伤，改善了心功能和组织学。此外，CSA 抑制胰腺和系统性促炎细胞因子的产生，其作用机制与降低M1巨噬细胞比例和提高M2 巨噬细胞比例有关。因此，CSA可能是治疗AP的一种有前途的药物。

在AP 的多器官系统功能障碍中，心脏损伤是相关表现的一部分，甚至致病［12］。AP期间可观察到心肌病变的改变。CK-MB、LDH和cTnT是心脏损伤高度可靠的生物标志物［13］。在本研究中，小鼠腹腔注射L-精氨酸刺激胰腺可引起胰腺明显的病理改变，血清淀粉酶和脂肪酶水平（胰腺损伤标志物）升高。此外，AP 动物表现出明显的心脏损害，心肌细胞凋亡和心肌相关酶CK-MB、LDH、cTnT 增加。以上结果表明，本研究成功建立了伴有心脏损伤的AP模型，与文献［14］一致。本研究结果提示CSA 预处理可明显改善胰腺和心脏组织病理学变化，逆转血清淀粉酶、脂酶和心脏相关酶变化。对AP 诱导的心脏损伤具有有益的作用。

越来越多的证据表明，参与AP 诱导的多器官功能障碍的致病因素包括全身炎症反应、氧化应激和循环蛋白水解酶［14］。炎症细胞因子在AP 的炎症反应中起关键作用。一方面，AP开始于局限性胰腺和胰周炎症。过度释放炎症介质将轻度AP 转化为重度AP，并进一步导致全身炎症反应综合征［14］。另一方面，随着AP、细菌和内毒素从肠道侵入血液系统，肠黏膜的免疫屏障受损，进一步诱导炎症介质释放［15］。许多促炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β，被认为参与了AP 发生，循环中这些介质的高水平表达可导致进一步的多器官衰竭［14］。已有研究表明CSA 在体内外均有抗炎作用。CSA 治疗降低了脂多糖诱导的巨噬细胞TNF-α 和IL-6 的产生［16］。XIAO等［17］报道CSA对LPS介导的炎症性肺损伤具有治疗潜力。与以上结果一致，本研究证明了CSA 预处理可显著降低全身炎症细胞因子，包括TNF-α 和IL-1β。因此，CSA 的心脏保护作用可能归因于其抗炎特性。QIAN等［18］证明，CSA对急性坏死性胰腺炎大鼠脑损伤的保护作用。本研究进一步证实了CSA在AP相关心脏损害中的有益作用。

在AP 情况下，宿主会产生极端的免疫反应。免疫功能障碍被认为是AP 全身炎症中的一个重要因素［14］。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞类型，通过影响炎症和免疫功能在AP 多个阶段发挥关键作用。M1 和M2 巨噬细胞的可塑性随AP 的发展而变化。M2 巨噬细胞参与炎症溶解和组织修复，这对AP 的治疗至关重要［5］。本研究分析了CSA 对脓毒症巨噬细胞M1/M2 极化的调节作用。本研究结果表明，CSA 在体外以剂量依赖的方式增加CD206 和CD23标志的巨噬细胞数量。在体内，CSA 诱导心脏巨噬细胞M2 极化，即F4/80+CD206+巨噬细胞占F4/80+细胞（总巨噬细胞）比例升高。以上发现与先前的研究一致，即表观遗传修饰物可以调节巨噬细胞表型［19］。PKM2 是巨噬细胞糖酵解重编程的关键决定因素［10］。PKM2 的单体和二聚体形式具有不活跃的丙酮酸激酶活性，促进巨噬细胞糖酵解和炎症反应。而PKM2的四聚体形式具有活性的酶丙酮酸激酶活性，可诱导TCA 循环、OXPHOS 和抗炎反应［10］。研究发现，通过内源性分子和合成化合物抑制PKM2 可以减轻巨噬细胞引起的炎症性疾病［20-24］。因此，研究进一步观察PKM2 是否作为CSA 的潜在靶点。结果显示CSA 预处理可能通过下调PKM2促进M2-巨噬细胞极化。

本研究结果表明，CSA 可以显著改善L-精氨酸诱导的AP 和相关心脏损害的严重程度。以PKM2为靶点的CSA 在AP 中的作用可能与增加M2 巨噬细胞数量、抑制促炎症细胞因子产生有关。因此，CSA可为胰腺疾病提供治疗潜力。