依托咪酯通过促进miR-142-3p表达减轻缺氧诱导的PC12细胞神经炎症反应和细胞凋亡的分子机制研究①

沈 磊 李明霞 彭 湃 周军格 杨 军 （长江航运总医院麻醉科，武汉 430000）

脑缺氧缺血可引起广泛的生物反应，包括去极化、兴奋性毒性、氧化应激、炎症和细胞凋亡，并导致神经变性［1］。依托咪酯是一种常用的静脉麻醉剂，可在麻醉期间保持良好的血流动力学稳定性。据报道，依托咪酯在非小细胞肺癌等癌症中发挥肿瘤抑制作用［2］。最近有报道称，依托咪酯具有神经保护作用。依托咪酯通过抗凋亡、抗氧化作用改善过氧化氢刺激的PC12细胞损伤，或减少细胞死亡对抗神经元缺氧损伤［3-4］。然而，依托咪酯是否会对缺氧诱导的PC12 细胞产生有益作用仍有待阐明。依托咪酯麻醉会在心血管中诱导不同的微小RNA（microRNA，miRNA）表达，如miR-129-5p、miR-105、miR-324-3p 等［5］。研究显示，miR-142-3p 对脑缺血/再灌注损伤发挥神经保护作用［6］。然而miR-142-3p对缺氧诱导的PC12 细胞损伤及依托咪酯能否通过调控miR-142-3p 减轻缺氧诱导的PC12 细胞损伤尚不明确。本研究旨在探究依托咪酯对缺氧诱导的PC12 细胞凋亡和炎症损伤的保护作用，并以miR-142-3p为切入点，阐明其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12 细胞（中国科学院上海细胞库）；依托咪酯（>98%）、CCK-8试剂（美国Sigma-Aldrich）；Lipofectamine 3000、TRIzol 试剂、TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（美国Invitrogen）；miR-con、miR-142-3p 模拟物、anti-miR-con、miR-142-3p 抑制物（antimiR-142-3p）（上海吉玛）；抗细胞周期蛋白D1（CyclinD1）一抗、抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved-caspase-3）一抗、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 试剂盒（美国Abcam）；细胞凋亡检测试剂盒、RIPA 缓冲液、BCA 蛋白定量试剂盒、ECL Plus试剂盒（上海碧云天）；SYBR Green Universal qPCR Master Mix（美国Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与缺氧损伤 采用含10%胎牛血清、37 ℃、含5%CO2、95%空气的DMEM 培养基培养PC12 细胞。缺氧损伤时，将PC12 细胞置于37 ℃、95%N2、5%CO2的缺氧培养箱中培养24 h［7］。

1.2.2 实验分组 将PC12 细胞分为对照组（正常培养）、缺氧组（缺氧处理24 h）、缺氧+不同剂量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯组（2、6、12 μmol/L 依托咪酯干预24 h 后，行缺氧处理）、miR-con+缺氧组（转染miR-con 后，行缺氧处理24 h）、miR-142-3p+缺氧组（转染miR-142-3p模拟物后，行缺氧处理24 h）、antimiR-con+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯组（转染antimiR-con 后，12 μmol/L 依托咪酯干预24 h，再行缺氧处理24 h）、anti-miR-142-3p+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯组（转染anti-miR-142-3p后，12 μmol/L依托咪酯干预24 h，再行缺氧处理24 h）。

1.2.3 CCK-8 法检测细胞活性 于96 孔板（2.5×104个/孔）培养细胞4 h，按照1.2.2 分组处理后，加入CCK-8（10 μl/孔）孵育2 h，酶标仪测450 nm 处吸光度（A）值。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 于6孔板（1.0×105个/孔）培养细胞4 h，按照1.2.2 分组处理后收集各组细胞，利用Annexin-V-FITC/PI 试剂盒，流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达 于6 孔板（1.0×105个/孔）培养细胞4 h，按照1.2.2 分组处理后，收集各组细胞。RIPA 试剂提取细胞中总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度后，10%SDS-PAGE 分离总蛋白，并转膜、封闭。分别于CyclinD1（1∶1 000）、Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）一抗中4 ℃孵育12 h，洗膜，再于二抗中37 ℃孵育2 h。显影，曝光，Image J软件进行蛋白灰度值分析。

1.2.6 ELISA 检 测TNF-α、IL-1β、IL-6 水 平 于6孔板（1.0×105个/孔）培养细胞4 h，按照1.2.2分组处理后，收集各组细胞培养上清液，350 g 离心10 min。取上清液，ELISA 试剂盒测定上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.2.7 RT-qPCR 检测miR-142-3p 表达 于6 孔板（1.0×105个/孔）培养细胞4 h，按照1.2.2 分组处理后，收集各组细胞。TRIzol试剂提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，行PCR 扩增。miR-142-3p 正向引物：5'-GCTCGACAAGGCTCGTTATGAA-3'，反向引物：5'-CCTTTGATTTTTGGGGCGGTA-3'；U6（对照）正向引物：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向引物：5'-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3'。2-ΔΔCt法计算miR-142-3p相对表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS22.0 软件分析数据。以±s表示计量资料。采用单因素方差分析比较多组间数据，SNK-q检验行组内比较；独立样本t检验分析两组间数据差异性。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 依托咪酯对缺氧处理的PC12细胞活性及凋亡的影响 与对照组比较，缺氧组PC12 细胞活性降低，凋亡率升高（P<0.05）。与缺氧组比较，缺氧+不同剂量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯组PC12 细胞活性呈增强趋势，细胞凋亡率呈降低趋势（P<0.05，图1、表1）。

表1 依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞活性及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of etomidate on activity and apoptosis of PC12 cells under hypoxia （±s，n=9）

表1 依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞活性及凋亡的影响（±s，n=9）Tab.1 Effects of etomidate on activity and apoptosis of PC12 cells under hypoxia （±s，n=9）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with hypoxia group， 2）P<0.05.

A value 1.056±0.10 0.513±0.051）0.679±0.062）0.825±0.082）0.902±0.092）63.768 0.000 Groups Control Hypoxia Hypoxia+2 μmol/L etomidate Hypoxia+6 μmol/L etomidate Hypoxia+12 μmol/L etomidate FP Apoptosis rate/%4.32±0.38 24.53±2.041）20.35±1.912）12.38±1.272）6.68±0.612）340.142 0.000

图1 流式细胞术检测细胞凋亡Fig.1 Detection of apoptosis by flow cytometry

2.2 依托咪酯对缺氧处理的PC12细胞中有关蛋白表达的影响 与对照组比较，缺氧组CyclinD1 蛋白表达量降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表达量增加（P<0.05）。与缺氧组比较，缺氧+不同剂量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯组CyclinD1 蛋白表达呈升高趋势，Cleaved-caspase-3 蛋白表达量呈降低趋势（P<0.05，图2、表2）。

表2 依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞中CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响（±s，n=9）Tab.2 Effect of etomidate on expressions of CyclinD1 and Cleaved-caspase-3 protein in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with hypoxia group， 2）P<0.05.

Cleaved-caspase-3 0.24±0.03 0.75±0.071）0.62±0.062）0.45±0.042）0.32±0.032）166.878 0.000 Groups Control Hypoxia Hypoxia+2 μmol/L etomidate Hypoxia+6 μmol/L etomidate Hypoxia+12 μmol/L etomidate F P CyclinD1 0.86±0.07 0.41±0.041）0.61±0.062）0.75±0.072）0.90±0.092）90.977 0.000

图2 Western blot 检测CyclinD1、Cleaved-caspase-3 蛋白表达Fig.2 Expressions of CyclinD1 and Cleaved-caspase-3 protein detected by Western blot

2.3 依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞炎症因子表达的影响 与对照组比较，缺氧组TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（P<0.05）。与缺氧组比较，缺氧+不同剂量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈降低趋势（P<0.05，表3）。

表3 依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞炎症因子表达的影响（±s，n=9，ng/L）Tab.3 Effects of etomidate on expressions of inflammatory factors in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9，ng/L）

表3 依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞炎症因子表达的影响（±s，n=9，ng/L）Tab.3 Effects of etomidate on expressions of inflammatory factors in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9，ng/L）

Note：Compared with control group， 1）P<0.05； compared with hypoxiagroup， 2）P<0.05.

Groups Control Hypoxia Hypoxia+2 μmol/L etomidate Hypoxia+6 μmol/L etomidate Hypoxia+12 μmol/L etomidate TNF-α 25.02±2.27 104.02±9.561）IL-1β 81.64±7.61 456.31±41.021）IL-6 12.17±1.14 64.58±6.111）81.17±7.522）384.97±33.142）48.67±4.282）60.53±5.242）254.67±22.132）32.61±2.942）42.19±3.912）147.84±12.572）19.54±1.512）FP 302.733 0.000 223.663 0.000 317.655 0.000

2.4 依托咪酯对miR-142-3p 表达的影响 对照组、缺氧组、缺氧+不同剂量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯组miR-142-3p 表达量分别为1.00±0.11、0.43±0.04、0.61±0.06、0.79±0.07、0.89±0.09。与对照组比较，缺氧组miR-142-3p 表达量减少（P<0.05）。与缺氧组比较，缺氧+不同剂量（2、6、12 μmol/L）依托咪酯组miR-142-3p表达量呈增加趋势（P<0.05）。

2.5 miR-142-3p 对缺氧处理的PC12 细胞活性、凋亡及炎症因子表达的影响 miR-142-3p+缺氧组PC12 细胞miR-142-3p 表达量、细胞活性、CyclinD1蛋白表达量较miR-con+缺氧组升高，Cleaved-caspase-3 蛋白表达量、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平、细胞凋亡率较miR-con+缺氧组降低（P<0.05，表4、图3）。

表4 上调miR-142-3p对缺氧处理的PC12细胞活性、凋亡和炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.4 Effects of up-regulation of miR-142-3p on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

表4 上调miR-142-3p对缺氧处理的PC12细胞活性、凋亡和炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.4 Effects of up-regulation of miR-142-3p on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

Note：Compared with miR-con+hypoxia group， 1）P<0.05.

A value 0.516±0.05 1.013±0.091）14.482 0.000 Groups miR-con+hypoxia miR-142-3p+hypoxia t P miR-142-3p 1.00±0.10 2.53±0.221）18.994 0.000 CyclinD1 0.42±0.04 0.88±0.081）15.429 0.000 Cleavedcaspase-3 0.76±0.07 0.37±0.031）15.363 0.000 TNF-α/（ng·L-1）105.11±9.25 30.94±2.341）23.321 0.000 IL-1β/（ng·L-1）455.61±41.02 95.56±9.161）25.699 0.000 IL-6/（ng·L-1）64.21±6.17 13.54±1.061）24.281 0.000 Apoptosis rate/%24.84±2.08 5.43±0.511）27.190 0.000

图3 上调miR-142-3p对缺氧处理的PC12细胞凋亡及相关蛋白表达的影响Fig.3 Effect of up-regulation of miR-142-3p on apoptosis of PC12 cells under hypoxia and expressions of related proteins

2.6 下调miR-142-3p 逆转依托咪酯对缺氧处理的PC12 细胞活性、凋亡和炎症因子表达的影响 antimiR-142-3p+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯组miR-142-3p表达量、细胞活性、CyclinD1蛋白表达量低于antimiR-con+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯组，Cleaved-caspase-3 蛋白表达量、TNF-α、IL-1β、IL-6 水平及细胞凋亡率均高于anti-miR-con+缺氧+12 μmol/L 依托咪酯组（P<0.05，图4、表5）。

表5 下调miR-142-3p逆转依托咪酯对缺氧处理的PC12细胞活性、凋亡和炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-142-3p reverses effects of etomidate on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

表5 下调miR-142-3p逆转依托咪酯对缺氧处理的PC12细胞活性、凋亡和炎症因子表达的影响（±s，n=9）Tab.5 Down-regulation of miR-142-3p reverses effects of etomidate on activity， apoptosis and inflammatory factors expressions in hypoxia-treated PC12 cells （±s，n=9）

Note：Compared with anti-miR-con+hypoxia+12 μmol/L etomidate group，1）P<0.05.

Groups anti-miR-con+hypoxia+12 μmol/L etomidate anti-miR-142-3p+hypoxia+12 μmol/L etomidate miR-142-3p CyclinD1 IL-1β/（ng·L-1）IL-6/（ng·L-1）A value 1.00±0.10 0.91±0.09 Cleavedcaspase-3 0.33±0.03 TNF-α/（ng·L-1）42.02±3.86 147.39±11.94 19.47±1.64 Apoptosis rate/%6.61±0.65 0.910±0.09 0.537±0.051）10.869 0.000 t P 0.48±0.041）14.484 0.000 0.45±0.041）14.012 0.000 0.71±0.071）14.969 0.000 94.13±8.531）16.697 0.000 421.57±40.011）19.700 0.000 67.94±5.971）23.487 0.000 23.18±1.991）23.745 0.000

3 讨论

缺氧可诱导神经细胞产生过度炎症反应，分泌大量炎症因子，造成神经细胞炎症损伤，这些炎症因子进一步刺激神经细胞，诱导神经细胞凋亡，抑制缺氧诱导的神经细胞炎症反应和凋亡对治疗脑缺氧十分关键［8-9］。大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12 高度分化后，具有神经细胞特性，常用作神经生物学和神经化学研究的模型细胞［10］。本研究发现，缺氧处理PC12细胞后，细胞活性降低，细胞凋亡增加，且炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌量增加，表明缺氧诱导PC12细胞损伤模型建立成功。

依托咪酯是一种常用的催眠和静脉麻醉剂，其还具有抗炎、抗细胞凋亡作用。例如，SUN 等［11］发现依托咪酯可抑制晚期糖基化终产物（AGEs）诱导的软骨细胞中IL-1β 和TNF-α 表达；LV 等［12］报道依托咪酯通过降低炎症标志物IL-6、IL-1β 和TNF-α 分泌防止心肌缺血再灌注损伤；ZOU 等［13］报道称，依托咪酯处理可通过降低TNF-α、IL-1β 表达、减少凋亡和坏死细胞数量缓解大鼠肢体缺血再灌注引起的肺损伤。本研究结果显示，依托咪酯剂量依赖性地提高缺氧诱导的PC12 细胞活性，减少细胞凋亡，并降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 分泌，表明依托咪酯可以保护PC12细胞免受缺氧诱导的损伤。

miRNA 参与调控细胞凋亡、炎症反应等生理、病理过程，可作为脑缺氧损伤治疗的分子靶点［14］。研究显示，miR-142-3p 在脑缺血再灌注小鼠大脑皮层和氧糖剥夺诱导的PC12细胞中表达增加［15］；在培养的背根神经节神经元中，miR-142-3p 模拟物通过促进细胞周期和抑制细胞凋亡增强细胞活力［16］。本研究结果显示，miR-142-3p在缺氧诱导的PC12细胞中表达降低，上调miR-142-3p 可抑制缺氧诱导的PC12细胞凋亡及炎症因子表达，提示miR-142-3p可作为减轻缺氧诱导的PC12 细胞损伤的分子靶点。WU 等［17］报道表明，麻醉剂右美托咪定通过调节miR-199a 保护PC12 细胞免受氧化损伤。本研究显示，依托咪酯上调缺氧诱导的PC12细胞中miR-142-3p 表达，而下调miR-142-3p 可逆转依托咪酯对缺氧诱导的PC12 细胞活性、凋亡及炎症因子表达的影响，提示其可能通过上调miR-142-3p 减轻缺氧诱导的PC12细胞损伤。

总之，依托咪酯通过上调miR-142-3p 表达抑制细胞凋亡和炎症反应，对缺氧诱导的PC12细胞表现出良好的保护作用。这可能为改善缺氧引起的神经细胞损伤开辟新视野。