基于微卫星多重PCR 的黄鳝亲子鉴定技术

鲁弘毅，田海峰，胡乔木，李 忠

1.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223

2.华中农业大学 水产学院，湖北 武汉 430070

黄鳝 (Monopterusalbus) 属于硬骨鱼纲、合鳃鱼目、合鳃鱼科，为淡水肉食性鱼类[1]，主要分布于中国、日本、印度，以及泰国、印度尼西亚、缅甸等一些东南亚国家[2]。在我国，黄鳝分布在除青藏高原以外的广泛区域，是我国重要的名特优淡水经济鱼类之一，其肉质鲜美，具有很高的营养价值[3]。根据《中国渔业统计年鉴》数据，湖北、江西、安徽、湖南、四川是我国黄鳝养殖主产区，在2016—2020 年间年均产量超30 万吨，其中湖北省的产量最高，其年产量占全国的40%以上[4-8]。黄鳝通常在完成第一次产卵后会由雌性转为雄性，导致适龄繁育的雌性亲本数量稀缺，极大限制了其产业发展[9]。目前，我国黄鳝养殖主要依赖于野生苗种捕捞，质量参差不齐，这种高强度捕捞对黄鳝养殖产业的可持续性及种质资源造成了极大破坏。在育种方面，目前尚无国家认定的黄鳝养殖品种，因此开展黄鳝品种选育、筛选优良品系、进行家系管理，是当下黄鳝育种工作中的迫切需求。笔者课题组已实现黄鳝全人工繁育技术的突破，已应用于规模化育苗，并开展了家系选育工作，为下一步黄鳝良种的选育奠定了基础。

在黄鳝后续良种选育工作中，亲子鉴定及系谱管理技术是避免其近交衰退的关键技术。传统家系选育工作存在繁琐及环境差异等问题，传统标记手段也存在幼体标记困难及造成应激、损伤、脱落等问题。开发高效亲子鉴定技术可为黄鳝良种选育和种质资源保护及利用提供技术支持。亲子鉴定又称亲权鉴定，可以通过遗传特征相互验证亲本和子代之间是否存在亲缘关系。在育种生产中开展亲子鉴定可有效避免近交导致的种质退化问题。微卫星序列 (Simple sequence repeats,SSR) 具有高度的多态性、稳定性、呈共显性遗传、数量丰富且遵循孟德尔遗传定律的优点，在水生动物亲子鉴定中应用广泛。文萍等[10]使用2 组微卫星多重PCR 体系对黄喉拟水龟 (Mauremysmutica) 进行亲子鉴定，在父本信息未知时，母本的鉴定准确率为87%；苗贵东等[11]通过2 组微卫星多重PCR 体系对大菱鲆(Scophthalmusmaximus) 7 个家系开展了亲子鉴定，准确率达到98.26%；谢敏敏等[12]通过建立2 组微卫星多重PCR 体系，对鼋 (Pelochelyscantorii)家系进行亲子鉴定分析，得到10 个位点的双亲排除率为98%；Dong 等[13]为了评估中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis) 养殖群体亲缘鉴定的可行性，使用5 个微卫星位点，获得了92.9%的鉴定成功率；辛苗苗等[14]使用7 个微卫星位点对多倍体中华鲟 (Acipensersinensis) 进行亲子鉴定分析，得到双亲累计排除率为99.99%；Yang 等[15]利用10 个微卫星位点对鳜 (Sinipercachuatsi) 5 个全同胞家系进行了亲子鉴定，得到的实际鉴定率为95%，且随机选择了69 个后代进行双盲试验，结果表明95% 的子代可以正确聚类；Zhu 等[16]筛选出了14 个用于评价斑节对虾 (Penaeusmonodon) 亲子关系的微卫星标记，并用其中多态性最高的6 个微卫星标记获得了99%的鉴定准确率。

目前，黄鳝已开发出较多的微卫星标记，如刘臻等[17]通过富集文库法开发了20 个微卫星标记，设计了8 对4 碱基重复高度多态性的微卫星引物，分析了3 种不同性别表型黄鳝群体的遗传多样性；Li 等[18]使用富集文库法分离了16 对微卫星引物，分析了两个黄鳝自然群体的遗传多样性和群体结构；Zhang 等[19]通过RAD (Restriction-site associated DNA tags，简化基因组) 测序在基因组中鉴定出了9 897 个微卫星，并筛选出28 对多态性引物。但上述研究开发的微卫星标记仅用于遗传多样性分析，目前尚未见利用微卫星多重PCR 体系对黄鳝进行亲子鉴定的相关研究报道。本研究利用笔者课题组前期发表的高度多态性微卫星标记[20]和基于黄鳝基因组数据开发的新的微卫星标记[21]，结合繁育的黄鳝全同胞家系，建立了基于微卫星多重PCR 的亲子鉴定技术，为后续黄鳝育种以及种质资源保护提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄鳝样本取自中国水产科学研究院长江水产研究所窑湾基地。雌、雄亲本按照1∶1 比例得到11 个全同胞家系，雌、雄亲本完成繁殖后取背部肌肉于-80 ℃保存，每个家系在孵化出膜至30 日龄随机选取10 尾于-80 ℃保存。随机挑选4 个黄鳝家系子代各10 尾和随机候选亲本4 尾，同样-80 ℃保存。

1.2 基因组DNA 的提取

基因组DNA 采用苯酚-氯仿法[22]提取，用1%(w) 琼脂糖凝胶电泳以及分光光度计检测DNA 浓度及完整性。将合格的DNA 用双蒸水 (ddH2O) 稀释至100 ng·μL-1，于-20 ℃保存。

1.3 多态性微卫星引物的筛选

黄鳝全基因组数据来源于中国科学院国家基因研究中心数据库 (CRA003062)。使用MISA 对黄鳝全基因组序列中的完美型SSR 进行检索[23]，检索标准与课题组前期筛选微卫星的标准一致。挑取了148 个SSR 位点，同时提取SSR 位点前后200 bp的序列，使用Primer premier 3.0 软件设计引物。随机选取6 尾黄鳝的混合DNA 为模板，进行微卫星引物的扩增效果及初步的多态性验证，共获得35 对扩增效果理想的引物。另挑选课题组前期发表的具有高度多态性的15 对微卫星引物，共50 对微卫星引物，以参与繁殖的22 尾黄鳝亲本DNA为模板进行筛选，选择扩增等位基因数较多、出峰质量较好的位点。

1.4 多重PCR 体系的构建及优化

对筛选获得的16 对微卫星引物进行荧光修饰(FAM、HEX、ROX、TAMRA) ，由武汉天一辉远科技有限公司合成，以亲本DNA 为模板进行多重PCR 构建。构建过程中避免产生引物二聚体、发卡结构和错配等现象，优化模板DNA 浓度、退火温度、延伸时间等反应条件。根据片段大小将引物分为两组，两组引物等比混合开展预实验，根据出峰结果调整引物浓度，最终确定最佳的多重PCR 体系。

PCR 反应体系10 μL，包含2×PCR Mix 5 μL，10 pmol·μL-1上下游引物各0.5 μL，基因组DNA 1 μL 以及灭菌超纯水3 μL。扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，62～53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共10 个循环，其中退火温度每次循环下降1 ℃；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 个循环；72 ℃延伸20 min。使用1% (w) 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的完整性，然后由ABI3730XL 测序仪进行毛细管电泳检测 (由武汉天一辉远生物科技有限公司完成)，使用GeneMarker[24]读取各位点等位基因大小。

1.5 数据统计及分析

将整理的亲本与子代基因型结果导入Cervus 3.0[25]进行等位基因频率分析、模拟分析和亲子鉴定分析。模拟分析设置模拟子代数为10 000 个，候选亲本数为父母本各11 对，对100%的候选亲本进行抽样模拟分析，允许1%的分型错误，置信度为95%。在性别已知和未知的情况下，基于16 个微卫星位点模拟分析不同候选亲本数情况下的鉴定率，设置模拟子代数目为10 000 个，候选亲本数分别为20、50、100、150 和200 对，抽样比例为100%，允许1% 的分型错误，置信度为95%。根据多态信息含量大小将16 个微卫星位点排序，分析微卫星位点数与鉴定率之间的关系。统计所有子代样本在某一位点出现的所有基因型，单个样本在该位点存在对应基因型则记为1，否则记为0，构建基因型0/1 矩阵，并根据该矩阵利用NTSYS软件[26]对110 尾家系子代进行聚类分析。利用NTSYS 软件对4 个家系共40 尾子代进行聚类分析，验证微卫星多重PCR 体系的准确率。

其中单个位点的非亲排除率 (NEP) 由Cervus 3.0 软件计算得到，累积非亲排除率 (CEP) 计算公式如下：

式中：RCEP为累积非亲排除率；RNEP,i为第i个微卫星位点的NEP 值；n为微卫星位点排除概率的数目。CE-1P 对应用NE-1P 计算，CE-2P 对应用NE-2P 计算，CE-PP 对应用NE-PP 计算。

2 结果

2.1 微卫星的筛选与多重PCR 建立

从黄鳝基因组预测的148 个微卫星位点，筛选获得了扩增效果较好的微卫星引物35 对。进而以30 尾亲本为模板，从50 对微卫星引物中筛选得到16 对多态性高、扩增效果好的微卫星引物。

将筛选的16 对微卫星引物进行不同组合并优化反应程序、调整引物浓度比例，最终确定2 组多重PCR (表1)。2 组多重PCR 的扩增效率都较好，分型结果符合预期。A 组多重PCR 体系各位点如见图1。

图1 A 组多重 PCR 的等位基因Fig.1 Alleles of multiplex PCR of Group A

表1 黄鳝 2 组微卫星多重PCR 的引物信息Table 1 Primer information of two multiplex PCR sets of microsatellites in M.albus

2.2 亲子鉴定分析

16 个微卫星位点在黄鳝22 尾亲本和110 尾子代中的遗传参数如表2 所示。等位基因数 (Na) 为3～9，平均等位基因数为5.562；观测杂合度和期望杂合度分别为0.421～0.771 和0.382～0.797，平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.627 和0.619；多态信息含量 (PIC) 为0.347～0.766，平均多态信息含量为0.564，其中Ma71、Ma78、Mta021、Mta027和Mta033 表现为中度多态性，其余11 个位点均表现为高度多态性。16 个位点均未偏离Hardy-Weinberg 平衡。

表2 16 个微卫星位点的遗传参数Table 2 Genetic parameters of 16 SSR loci

将16 个微卫星位点根据多态信息含量由大到小排序探究微卫星数量与鉴定率之间的关系。结果如图2 所示，随着微卫星位点数的增加，亲子鉴定的模拟鉴定率和实际鉴定率逐渐上升。当位点数为8 时，亲子鉴定的模拟鉴定率和实际鉴定率均达到95%。当位点数继续增加，模拟鉴定率无限接近100%，实际鉴定率则保持在95%左右。实际亲子鉴定结果显示，110 尾子代中仅有6 尾子代的三联LOD≤0，无法准确匹配到真实的父母本，运用16 个微卫星位点的实际鉴定成功率为95%。

图2 微卫星位点数与鉴定率Fig.2 Number and identification rate of SSR loci

利用构建的2 组多重PCR 体系计算黄鳝11 个家系单个位点的排除概率和累计排除概率，结果见表2。NE-1P、NE-2P、NE-PP 分别为0.570～0.928、0.393～0.803、0.143～0.675，CE-1P、CE-2P、CE-PP 分别为0.999 999 99、0.999 999 91、0.999 964 76，模拟亲本已知的情况准确率为99.96%，置信度为95%。说明在理想情况下，使用这16 个微卫星标记进行黄鳝的亲子鉴定可以在置信度95%的情况下达到99.96%的准确率。

此外，分别开展了在候选亲本性别已知和未知的情况下进行不同候选亲本数 (20、50、100、150、200 对) 的模拟分析。结果如图3 所示，当候选亲本数为20 对，在候选亲本性别已知或未知的情况下，父本、母本和父母本联合都能够得到99%以上的鉴定率。当候选亲本数为50 对时，无论父母本性别是否已知，父母本联合的鉴定率也都在95%左右，单亲本的鉴定率也在93%左右。当候选亲本数为100 对时，无论父母本性别是否已知，父母本联合的鉴定率保持在95%以上，但单亲本的鉴定率下降到了90%以下。当候选亲本数为150 对时，在候选亲本性别已知和未知的情况下，父母本联合仍然能够得到95% 以上的鉴定率。当候选亲本数继续增加至200 对时，鉴定率在父母本联合且性别已知的情况下依然有较高的鉴定率 (94.88%)，而在性别未知的情况下，鉴定率明显下降 (89.56%)。单亲本的鉴定率在亲本数为200 对时下降至80%左右。

图3 黄鳝16 个微卫星标记基于不同亲本数的模拟分析Fig.3 Simulation analysis of 16 pairs microsatellite markers of M.albus based on different candidate parent

2.3 家系聚类分析

NTSYS 聚类分析的结果如图4 所示，结果表明11 个家系的子代仅有2 尾无法正确聚类，分别为个体1-07 和101-07，其余子代个体均可以正确聚类，鉴定准确率为98.18%。

图4 110 个黄鳝家系聚类分析图注：右侧数字代表家系，其中1-07 和101-07 为聚类错误的子代编号。Fig.4 Cluster analysis diagram of 110 families of M.albusNote: The numbers on the right represent families,and 1-07 and 101-07 are clustered incorrectly.

2.4 群体遗传多样性分析

利用两组多重PCR 体系对黄鳝11 个子代家系群体和全部候选亲本群体独立进行遗传多样性分析，结果见表3。11 个子代家系群体的平均等位基因数为0.489，平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.632 和0.489，平均多态信息含量为0.394。比较候选亲本群体和11 个子代家系群体的遗传多样性，发现候选亲本群体的平均等位基因数、观测杂合度和多态信息含量均要高于11 个子代家系群体。

表3 黄鳝子代和亲本群体的遗传多样性Table 3 Genetic diversities of offsprings and parents of M.albus

2.5 亲子鉴定的应用

利用另外4 个家系的子代和候选亲本44 尾个体进行聚类分析。结果如图5，表明仅有个体10-04 和23-08 无法正确聚类，子代聚类准确率为95%，并且所有4 个候选亲本均能正确聚类，说明本实验建立的微卫星多重PCR 体系可以用于黄鳝家系的亲子鉴定。

图5 亲子鉴定应用聚类分析注：“-”前的数字代表家系、后面的数字代表子代标号，M 代表家系对应的母本，F 代表家系对应的父本，其中10-04 为聚类错误的子代编号。Fig.5 Cluster analysis of parentage test applicationNote: The number before "-" represents the family; the number after "-" represents the offspring label; M represents the female parent corresponding to the family; F represents the male parent corresponding to the family,and 10-04 was clustered incorrectly.

3 讨论

3.1 微卫星多重PCR 体系

自20 世纪80 年代Chamberlain 等[27]成功建立多重PCR (Multiplex polymerase chain reaction,MPCR) 体系以来，以其高效、敏感、大幅降低成本、提高检测效率的优势，在基因分型、遗传分析等领域得到广泛应用[28-31]。建立多重PCR 反应体系，需要保证同种荧光标记引物的扩增产物不会重叠，以避免基因型误读，从而实现多重优势。本实验筛选获得16 个微卫星位点的平均He、平均Ho和平均PIC 分别为0.627、0.619 和0.564。根据Botstein 的标准[32]，11 个位点为高度多态性位点，5 个位点为中度多态性位点，这一结果与在兰州鲇(Siluruslanzhouensis)[33]和圆口铜鱼 (Coreius guichenoti)[34]中用于亲子鉴定的微卫星位点多态性水平相近，表明这16 个位点具有丰富的遗传多样性，能够用于后续的亲子鉴定。张毅等[35]提出影响多重PCR 的关键因素是体系中引物之间是否兼容以及引物浓度的比例。本实验将16 对微卫星引物依据扩增产物的片段大小及初步实验，在退火温度确定的情况下根据电泳结果不断地调整引物浓度的比例来保证每对引物的扩增效果，最终构建了2 组多重PCR 体系，包括A 组的十二重PCR 体系和B 组的四重PCR 体系。其中本实验A 组十二重PCR 体系经过不断调整最终确定了各引物浓度的比例，而B 组四重PCR 体系仅实验一次就获得了良好的扩增效果，说明当多重PCR 体系中引物数量多的时候，引物浓度的比例尤为重要。

3.2 微卫星标记在黄鳝亲子鉴定中的应用

近年来，微卫星亲子鉴定被广泛应用于种质资源保护、新品种选育及种群遗传管理等方面，尤其在品种选育工作中能避免近亲交配并指导生产[36-38]。在微卫星亲子鉴定中，主要根据累计排除概率(CE-PP) 判定。赵桐茂[39]研究表明，如果CE-PP<80%，则不能确定存在亲子关系；如果95%

在亲子鉴定中出现实际鉴定率低于模拟鉴定率的情形，原因可能是基因型误读及无效等位基因的存在[42]。根据O'reilly 等[43]的研究，在基因分型过程中存在2%～3%的分型错误；此外，二、三碱基重复的微卫星标记在读取基因型大小时可能会因为碱基重复单元较短而出现基因型的误读，使得基因分型的结果存在一定误差。本实验中，实际鉴定率(95%) 略低于模拟鉴定率 (99.96%) ，筛选的16 个微卫星位点中有且仅有一个位点 (Ma85) 的无效等位基因频率大于10%，这可能是造成实际鉴定率略低的原因。

3.3 群体的遗传多样性分析

群体的遗传多样性主要通过有效等位基因数、杂合度 (Ho/He) 和多态信息含量表示，遗传参数越高，多态性越高，说明群体的遗传多样性越高。通过分析发现，各个位点的PIC 与NE-PP 大致呈反比关系，与韩叶等[44]对大麻哈鱼 (Oncorhynchus keta) 的研究结果一致。比较各子代家系与亲本群体之间的遗传多样性，发现亲本群体的平均期望杂合度和平均PIC 均高于子代各群体，说明亲本群体的遗传多样性高于各子代家系群体的遗传多样性，在各子代家系群体中，子代家系81 的杂合度最高，子代家系101 和子代家系77 次之。比较各子代家系群体之间的多态信息含量，发现子代家系101 的多态信息含量最高，子代家系81 和41 次之。综合杂合度和多态信息含量的比较，得出子代家系81 和101 具有较高的遗传多样性，说明其具有较高的育种潜力，可以作为家系选育的基础群体。11 个子代家系群体观测杂合度为0.631，期望杂合度为0.618，多态信息含量为0.562，整体而言杂合度和多态信息含量均低于我国长江中下游湖北、安徽、江苏、浙江4 省的野生黄鳝群体[45-46]和江西1个野生黄鳝群体，但高于天津3个野生黄鳝群体[47]，说明选育家系子代群体的遗传多样性相比野生群体有所下降。

4 结论

本研究筛选得到了16 个高度多态性的微卫星标记，建立了2 组可用于黄鳝亲子鉴定的微卫星多重PCR 体系，在黄鳝110 尾子代及22 尾亲本中达到了95%的鉴定率，研究结果有助于黄鳝的家系选育与管理，并可为其种质资源保护和良种选育提供理论依据和技术手段。