氨糖软骨素钙片安全性毒理学试验研究

殷光玲，贤 欢，肖义然，黄远英

（汤臣倍健股份有限公司营养健康研究院，广东 广州 510700）

氨糖软骨素钙片是一种以氨基葡萄糖、硫酸软骨素、骨碎补、CaCO3和酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptide，CPP）为主要原料的保健食品，具有增加骨密度的作用。本产品所添加的5 个主要原料均有相关研究证明其在增加骨密度方面的作用。氨基葡萄糖是关节软骨组织的主要成分之一，外源性补充氨基葡萄糖可促进软骨胶原合成，维持关节软骨结构的完整性，促进钙沉积，增强骨密度[1]。已有动物试验证明氨基葡萄糖可逆转骨量的丢失，改善骨质疏松[2]。硫酸软骨素是一种糖胺聚糖，是结缔组织的成分之一，大量文献报道了其对骨关节炎的改善作用[3-4]。有研究表明，硫酸软骨素和氨基葡萄糖联用，对于骨质疏松的预防和治疗具有协同增效作用[5]。骨碎补是药典记载的一种根茎类中药，属水龙骨科，国内外已有较多研究表明其可有效抑制骨质流失、加速骨骼伤患的康复，骨碎补黄酮是主要的功效物质[6]。钙是人体骨骼的主要成分，确保体内血钙的正常水平对于防治骨质疏松症尤为重要[7-8]。而CPP 作为一种牛乳水解活性肽，由于其分子结构中含有持钙能力较强的阴离子簇，可促进人体对钙离子的吸收。动物试验表明，CPP 与钙同时摄入，可提高体内血清和股骨钙水平，增强骨密度[9-11]。已有较多研究报道了氨糖软骨素钙片中各主要功能原料的功效性，而对于几种功能原料组成的复合物的安全性，尚无相关文献报道。本研究以氨糖软骨素钙片为受试物，通过动物试验评估，获取系统的安全性数据。

1 材料与方法

1.1 试验样品

氨糖软骨素钙片：由汤臣倍健股份有限公司提供，人体口服剂量为0.069 g·（kg bw）-1。取样品用粉碎机粉碎成粉末后进行试验。

1.2 试验动物

SPF 级昆明种小鼠和SD 大鼠：长沙市天勤生物技术有限公司，试验动物生产许可证号SCXK（湘）2014-001。

1.3 仪器与试剂

SYSMEX XT-2000i 全自动血球计数仪，日本希森美康；BECKMAN COULTER AU 680 全自动生化分析仪，美国贝克曼库尔特；METTLER TOLEDOAB204-N 分析天平，梅特勒托利多；叠氮钠（NaN3），Ruibio；2-氨基茐、9-茐酮，Aladdin；丝裂霉素C（Mitomycin C，MMC），购自Roche；1,8-二羟基蒽酮，Sigma；S9 混合液，上海齐源生物；环磷酰胺，上海瑞永生物科技有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 小鼠急性经口毒性试验

参照GB 1519.3—2014[12]，采用最大耐受剂量法进行急性毒性试验，选用小鼠作为试验动物，以羧甲基纤维素水溶液作为受试物溶剂，受试液浓度为50%，单次灌胃剂量为20.0 g·（kg bw）-1。灌胃后14 d 内，监测小鼠生长状态。

1.4.2 Ames 试验

参照GB 15193.4—2014[13]，用于测试的菌株为鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102。设溶剂对照组（二甲亚砜）、阳性对照组、自发回变组和受试样不同剂量组（8 μg/皿、40 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿、5 000 μg/皿）。其中不同组别中阳性对照设置内容：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9 的阳性对照为2-AF（10.0 μg/皿）；TA97a-S9、TA98-S9组阳性对照为9-芴酮（0.2 μg/皿）；TA100-S9 组阳性对照为NaN3（1.5 μg/皿）；TA102+S9 组阳性对照为1,8-二羟蒽醌（50.0 μg/皿）；TA102-S9 组阳性对照为MCC（0.5 μg/皿）。

若回变菌落数是自发回变组的2 倍及以上，并呈现剂量效应，则判断为阳性结果。

1.4.3 小鼠骨髓红细胞微核试验

参照GB 15193.5—2014[14]，经口灌胃，采用30 h给受试物法。受试小鼠随机分为5组，设阳性对照组（环磷酰胺）、阴性对照组（1%羧甲基纤维素）和受试样不同剂量组[低剂量组2.5 g·（kg bw）-1、中剂量组5.0 g·（kg bw）-1、高剂量组10.0 g·（kg bw）-1]，每组10 只。给药结束后处死小鼠，取胸骨制成细胞悬液涂片。观察并计算含微核嗜多染红细胞（Polychromatic Erythrocytes，PCE）千分率和嗜多染红细胞占总红细胞的比值（PCE/NCE）。

1.4.4 小鼠精原细胞染色体畸变试验

参照GB 15193.8—2014[15]，进行小鼠精母细胞致畸试验，受试动物小鼠随机分为5 组，每组5 只。灌胃剂量同1.4.3，连续灌胃5 d，每天1 次。给药结束后第14 天将小鼠处死，取附睾涂片，伊红染色，观察并计算精原细胞染色体畸变发生率。

1.4.5 30 d 喂养试验

参照GB 15193.22—2014[16]，取SD 大鼠80 只，随机分为4 组，即对照组（基础饲料）和低、中、高剂量组[分别为1.72 g·（kg bw）-1、3.45 g·（kg bw）-1、6.90 g·（kg bw）-1]，每组20 只。低、中、高3 个剂量组分别按1.72%、3.45%、6.90%的比例添加样品，周期为30 d。

试验期间试验动物自由饮水和摄食，记录摄食量和体重增长情况，以及其他行为表现。给药结束，采集大鼠血样，进行血常规和生化指标检测。采血后颈椎脱臼处死试验大鼠进行大体解剖，称量各主要脏器质量，计算相对重量（脏/体比值），同时进行组织病理切片观察。

2 结果与分析

2.1 小鼠急性经口毒性试验

由表1 可知，试验小鼠以受试样品进行单次大剂量（20.0 g·kg-1）灌胃后，2 周内的体重增长未受影响，未出现死亡或中毒反应等现象。试验动物处死后，进行解剖检查，各主要脏器均未发现病变。故氨糖软骨素钙片对试验小鼠的最大耐受剂量大于20.0 g·（kg bw）-1，根据GB 15193.3—2014 中的分级标准，属无毒级。

表1 小鼠经口急性毒性试验结果表

2.2 Ames 试验

由表2 可知，对于4 株菌株，阳性对照组中回变菌落数均在自发回变组2 倍以上，呈现阳性结果；而受试样不同剂量组（8～5 000 μg/皿）中，无论是否加S9 溶液，样品给药组回变菌落数均低于自发回变组的2 倍，未出现阳性结果。

表2 样品Ames 试验结果表（）

表2 样品Ames 试验结果表（）

2.3 小鼠骨髓红细胞微核试验

由表3 可知，与对照相比，受试样品给药组微核率无显著差异（P＞0.05），而阳性对照组（环磷酰胺）则出现了显著升高的现象（P＜0.05）。同样，与阴性对照相比，各组PCE/NCE比值也并无显著差异。此结果表明，受试样品组小鼠骨髓细胞的有丝分裂正常，染色体并未出现损伤，未出现异常毒性反应。

表3 小鼠骨髓微核发生率表

2.4 小鼠精原细胞染色体畸变试验

由表4 可知，与阴性对照相比，不同剂量受试样品组的小鼠精原细胞染色体畸变发生率无显著性差异（P＞0.05），而阳性对照（环磷酰胺）的畸变率与对照组相比，则出现了显著升高的现象（P＜0.05）。该结果表明，受试样品对于试验雄鼠的精子无毒性作用，即未发现遗传毒性。

表4 小鼠精原细胞染色体畸变发生率表

2.5 30 d 喂养试验

2.5.1 受试样品对大鼠摄食情况和体重的影响

由表5 可知，喂养期间，不同剂量受试样品组雌、雄鼠的摄食量、体重增长量和食物利用率，与对照组相比，均没有显著性差异（P＞0.05）。受试样品组大鼠的生长状态无异常，未出现死亡现象，依据所记录动物的行为表现和精神状态，未出现明显中毒反应。

表5 试验大鼠总食物利用率表（）

表5 试验大鼠总食物利用率表（）

2.5.2 样品对大鼠血常规和生化指标的影响

大鼠30 d 喂养试验结束时，不同剂量受试样品组的雌、雄大鼠与对照组相比，血常规各项指标（红细胞、白细胞、淋巴细胞等）均无显著性差异（P＞0.05），见表6。同样，与对照组大鼠相比，不同剂量受试样品组大鼠的生化指标（谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐和血糖指标等），也均无显著性差异（P＞0.05），见表7。结果表明，氨糖软骨素钙片给药后，试验大鼠的血液学细胞计数、肝肾功能等体征均未出现异常，生化指标上未表现出毒性反应。

表6 大鼠30 d 喂养试验末期血液学检查结果表（x-±s）

表7 大鼠30 d 喂养试验末期生化指标检查结果表（）

表7 大鼠30 d 喂养试验末期生化指标检查结果表（）

2.5.3 解剖及组织病理结果

30 d喂养结束后，对大鼠进行解剖，各主要脏器（肺部、心脏、脾脏、肝肾、生殖器官等）组织形态未出现肉眼可见的异常病态。高剂量组雌性大鼠和雄性大鼠的肝、脾、肾、胃、肠、睾丸（卵巢）均未见明显与试验因素有关的病理组织学变化。综上所述，以氨糖软骨素钙片为受试物进行的30 d 喂养试验表明，喂养期间，试验动物的生长情况未出现异常，机体状态良好（摄食与增重、生化和血常规、主要脏器绝对和相对重量等）。组织病理检查未发现明显有关的异常改变，表明氨糖软骨素钙片无明显毒副作用。

3 结论

人体试验表明，氨基葡萄糖可有效治疗膝骨关节炎，显著降低患者的疼痛程度，且具有良好的安全性和耐受性[17]。硫酸软骨素在国内外也被用作治疗骨关节炎的对症药物，其长期安全性临床试验中尚未报告任何明显的副作用[18]。氨基葡萄糖与硫酸软骨素联用，可有效缓解骨关节炎患者的疼痛感，且具有良好的耐受性[19]。骨碎补总黄酮已作为一种药品，被应用于骨质疏松症的治疗，对改善患者的骨密度具有一定的辅助治疗作用，且具有良好的安全性[20]，尚未报道有严重的药物不良反应，仅少数病例报道了肠道不适等轻微副作用[21]。但此前尚无研究报道氨基葡萄糖、硫酸软骨素、骨碎补、CaCO3和CPP 复合物的安全性，本试验首次研究了由此5 种功能原料，经科学配比复配制备的复合物的安全性。研究结果表明，本受试物以20.0 g·kg-1剂量单次给小鼠灌胃后，未出现毒副作用表现，最大耐受剂量大于20.0 g·kg-1。根据GB 15193.3—2014 的分级标准，属无毒级。Ames 试验、哺乳动物红细胞微核试验、精原细胞染色体畸变试验均表明无致突变作用；30 d 喂养期间，试验动物生长情况无异常，未出现中毒症状和死亡现象，表明氨糖软骨素钙片具有长期食用安全性。本次毒理学试验结果表明，氨糖软骨素钙片作为一款保健食品，具备良好的安全性。