胃癌组织中miR-219a-5p 的表达及其临床意义

张慧芳 朱青青★ 许文婷 程孝惠 李露露 赵奎

胃癌是临床常见消化道性肿瘤疾病，其确诊患者中以进展期胃癌患者为主，具有较高的发病率及死亡率［1］。通过相关因子表达检测，对恶性肿瘤病情进行准确评估和预后早期预测从而指导其有效干预为目前研究热门方向。微小核糖核酸（Microribonucleic acid，miRNA/miR）参与恶性肿瘤细胞的增殖和凋亡的调节，可通过调控靶基因转录参与肿瘤疾病的发生、发展乃至化疗耐药等［2］。miR-219a-5p为抑癌基因，在乳腺癌、肺癌、骨肉瘤等多种肿瘤疾病中可通过沉默相应的癌基因而抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，且已有研究证实其在胃癌组织中的表达水平较低［3-6］。但关于miR-219a-5p与胃癌病情、预后等方面的关系尚不明确。因此，本研究通过回顾性分析，进一步确定miR-219a-5p在胃癌组织中的表达状况，并分析其与临床病理特征、生存预后的关系，旨在为胃癌病情和预后评估提供参考指标，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019 年1 月至2021 年12 月于苏州大学附属第二医院行手术治疗且符合下述纳排标准的102 例胃癌患者临床资料。102 例胃癌患者中，男性患者68 例，女性患者34 例；平均年龄（65.87±8.69）岁，年龄≥60 岁65 例，年龄＜60 岁37例；肿瘤最大直径平均值（4.81±0.77）cm；肿瘤淋巴结转移分类（Tumor node metastasis classification，TNM）［7］分期为Ⅰ期13 例，Ⅱ期25 例，Ⅲ期35 例，Ⅳ期29 例；低分化18 例，中分化29 例，高分化55 例；有远处转移19 例，无远处转移83例；有肌层浸润37 例，无肌层浸润65 例；随访至2022 年10 月，患者平均随访时间为（23.85±7.59）个月，截至随访时间死亡11 例，病死率为10.78%（11/102）。

纳入标准：经活检或术后病理（图1、图2）检查确诊为胃癌；首次确诊，确诊前未经放疗、化疗或其他抗癌治疗；检查完善且临床资料完整；手术并保留有足够癌组织和癌旁组织蜡块。排除标准：合并其他消化系统疾病患者；合并其他原发性恶性肿瘤疾病患者；合并免疫功能缺陷疾病患者；随访资料不完善患者。本研究已通过院伦理审批，所有患者及家属均签署知情同意书。

图1 胃癌活检病理检查图片（HE，×400）Figure 1 Pathological picture of gastric cancer biopsy（HE，×400）

图2 胃癌术后病理检查图片（HE，×400）Figure 2 Postoperative pathological examination of gastric cancer（HE，×400）

本研究研究通过苏州大学附属第二医院伦理委员会的伦理学审核（批准文号：NO.2019L-00173），且患者均知情同意。

1.2 研究方法

收集患者的性别、年龄、最大肿瘤直径、TNM分期、分化程度、远处转移情况、肌层浸润情况、随访至2022 年10 月的生存预后情况等。

取患者手术时切除和4%多聚甲醛保存的胃癌组织蜡块（石蜡包埋肿瘤组织块，体积1 cm×1 cm×1 cm）和相应癌旁（距肿瘤边缘＞3 cm）组织蜡块（石蜡包埋组织块，体积1 cm×1 cm×1 cm）进行检测。取待检测样本组织1.0 cm ×0.5 cm×0.5 cm，液氮冻存的待检测样本组织进行组织？细胞进行裂解制成细胞匀浆，12 000 rpm、离心半径为3 cm、4℃离心10 min 后根据照Trizol 操作说明书常规进行总RNA 的提取。进行RNA 纯度和完整性检测后，进行microRNA 的逆转录，逆转录完成后进行逆转录引物及模板退火。采用实时定量聚合酶链反应法检测比较胃癌组织和相应癌旁组织中miR-219a-5p相对表达量。miR-219a-5p、U6引物均由广州锐博生物科技有限公司设计合成，引物情况如下：miR-219a-5p上游引物：5′-GTTCTTGACAATTAAGACCC-3′，miR-219a-5p下游引物：5′-CATGATAAGTTCTGCGCTC-3′；U6上游引物：5′-GCCAACGTCAGTAGGCAGA-3′，U6下游引物：5′-GCCAACCATGATCTGCTGAAAC-3′。PCR 反应体系为：2x SYBR Green Mix 10 μL，上游引物（5 μm）0.8 μL，下游引物（5 μm）0.8 μL，microRNA 1转1产物2 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL，总体积20 μL。PCR 反应条件为：95℃预变性10 min（1 个循环）、95℃扩增反应2 s（40 个循环）、60℃扩增反应20 s（40 个循环）、70℃扩增反应10 s（40 个循环）、95℃溶解曲线分析20 s（1 个循环）。对扩增曲线进行2-ΔΔCT法分析，以细胞内有核小RNA（small nuclear RNA，snRNA）U6为内参，计算miR-219a-5p相对表达量，进行3 次检测实验取平均值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件包进行统计学数据分析。计量资料均符合正态分布且方差齐，采用（）表示，两组间比较采用t检验，多组间采用方差分析，并通过SNK-q检验进行进一步的两两比较。采用ROC 曲线分析患者胃癌组织miR-219a-5p相对表达量对其生存预后的判断效能。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织蜡块和相应癌旁组织蜡块中miR-219a-5p 相对表达量比较

102 例患者胃癌组织中miR-219a-5p相对表达量平均为（0.759±0.239），明显低于其癌旁组织的（2.148±0.582），差异有统计学意义（t=22.297，P＜0.001）。

2.2 不同临床病理特征、生存预后患者的胃癌组织miR-219a-5p 相对表达量比较

随着TNM 分期增加，胃癌组织miR-219a-5p相对表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；随着肿瘤分化程度升高，胃癌组织miR-219a-5p相对表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；有远处转移患者胃癌组织miR-219a-5p相对表达量低于无远处转移患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；有肌层浸润患者胃癌组织miR-219a-5p相对表达量低于无肌层浸润患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

死亡患者的胃癌组织miR-219a-5p相对表达量低于存活患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征、生存预后患者的胃癌组织miR-219a-5p 相对表达量比较（）Table 1 Comparison of miR-219a-5p relative expression in gastric cancer tissues of patients with different clinicopathological characteristics and survival prognosis（）

表1 不同临床病理特征、生存预后患者的胃癌组织miR-219a-5p 相对表达量比较（）Table 1 Comparison of miR-219a-5p relative expression in gastric cancer tissues of patients with different clinicopathological characteristics and survival prognosis（）

注：与Ⅰ期患者比较，aP＜0.05；与Ⅱ期患者比较，bP＜0.05；与Ⅲ期患者比较，cP＜0.05。与低分化患者比较，dP＜0.05；与中分化患者比较，eP＜0.05。

2.3 患者胃癌组织miR-219a-5p 相对表达量对其生存预后的判断效能分析

ROC 曲线分析结果显示，胃癌组织中miR-219a-5p相对表达量预测胃癌患者死亡的曲线下面积为0.890（95%CI：0.823～0.958），判断阈值为0.426 时，敏感度为81.82%，特异度为92.31%。见表2、图3。

表2 患者胃癌组织miR-219a-5p 相对表达量对其生存预后的判断效能Table 2 Evaluation of the survival prognosis of patients with gastric cancer by the relative expression of miR-219a-5p

图3 ROC 曲线Figure 3 ROC curve

3 讨论

作为消化系统常见恶性肿瘤，胃癌在我国的发病率居于恶性肿瘤的前五位，已成为严重我国居民健康的疾病［8］。胃癌疾病周期长，从胃息肉良性到恶性转变过程中，多数患者并无明细那的症状，胃癌筛查和早期诊断技术目前尚不完善，因此，多数患者确诊时已进展为胃癌而预后情况较差［9］。本研究中，102 例胃癌患者多数年龄在60 岁以上，TNM 分期以Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期为主、中低分化癌患者亦占据相当一部分的比例，部分患者出现了远处转移和肌层浸润，而患者病死率高达10.78%，患者确诊时的病情多数较为严重，患者预后情况仍不乐观。胃癌的发生发展涉及多个基因，其中肿瘤细胞特异性抗原在胃癌早期检出中具有一定的应用价值，但其特异度较低［10］。探寻更高敏感度和特异度的胃癌诊治参考指标，以指导其有效治疗和改善预后均具有重要意义。

miRNA 在肿瘤细胞生长、分化、凋亡等过程中的作用备受关注，miRNA 的异常表达参与多种肿瘤疾病的发生和发展［11］。miRNA 为长度只有20～22 个核苷酸的微小RNA，参与基因翻译后的修饰调控，转录后负性调控靶基因表达从而参与肿瘤发生发展，且部分miRNA 具有一定的组织特异性，只在特定的某些器官组织中表达［12］。miR-219a-5p已被发现在多种肿瘤疾病中的表达呈现下调状态，参与恶性肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭等［13］。本研究检测了miR-219a-5p在胃癌组织及其癌旁组织中的表达，结果显示，相对于在癌旁组织中的表达为（2.148±0.582），miR-219a-5p在胃癌组织中的相对表达量仅为（0.759±0.239），呈现明显的降低，与罗敏等［6］研究中miR-219a-5p在胃癌组织中的为（0.769±0.95）的表达量差异不大，均提示miR-219a-5p在胃癌组织中表达下调，可能参与胃癌发生发展，可能用于其病情进展情况等的评估，但目前miR-219a-5p在胃癌病情及预后评估中的应用价值尚不明确，需进一步研究证实。

因此，本研究对不同临床病理特征、生存预后状况胃癌患者的胃癌组织miR-219a-5p 相对表达量进行比较分析，结果显示，胃癌组织miR-219a-5p相对表达量随着TNM 分期的增加而降低，随着肿瘤分化程度升高而升高，有远处转移、肌层浸润情况患者及随访期间死亡患者均具有更低的胃癌组织miR-219a-5p相对表达量，提示胃癌组织miR-219a-5p相对表达量与其患者的TNM 分期、肿瘤分化程度、远处转移、肌层浸润等临床病理特征情况及生存预后均有一定的关系，可能用于其病情和预后评估。进一步绘制ROC 曲线对胃癌组织miR-219a-5p相对表达量的患者死亡风险早期预测价值进行评估，结果显示，判断阈值为0.426 时，胃癌组织中miR-219a-5p相对表达量预测胃癌患者死亡风险的敏感度为81.82%，特异度为92.31%，准确性为91.18%，曲线下面积为0.890（95%CI：0.823～0.958），胃癌组织中miR-219a-5p相对表达量预测胃癌患者死亡风险的效能较高，尤其是胃癌组织中miR-219a-5p 相对表达量在0.426以下时提示患者高不良生存预后分析，需密切关注患者病情和及时采取措施，减少患者死亡等不良预后的发生。

综上所述，miR-219a-5p在胃癌组织中的表达水平下调，且与患者临床病理特征、生存预后均具有密切相关，可作为患者死亡风险的早期判断参考指标，指导患者病情和死亡风险评估及有效干预，以改善胃癌患者病情和预后，提高疾病治疗水平。