外周血miR-326 和miR-532-3p 预测妊娠期糖尿病发病风险的潜在价值

林慧贞 黄俊驹 刘小妹 谭瑾琳 冯晓辉 阮则凡 谢龙★

妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM）是孕妇在妊娠期间发生的糖代谢异常，出现高血糖等症状的常见并发症之一［1］。国际糖尿病协会的最新数据显示，全球约有14%的孕妇受到GDM 的影响［2］，而我国的患病率约为11.90%［3］。目前，口服葡萄糖耐量试验是主要的筛查方法，但其耗时长［4］，不利于早期诊断及治疗。早期诊断作为预防GDM 的有效手段，但受内外环境因素及诊断标准参差不齐的影响，仍未有理想的早期诊断方法或生物标志物［5-6］。因此，寻找早期诊断方法或具有预测潜力的生物标志物成为GDM 领域的研究热点之一。分子诊断是疾病诊断领域发展迅猛的一种方式。其中高通量测序技术作为一种新兴技术，为疾病早期的生物标志物筛查及疾病诊断提供了准确且高效的工具［7］。高通量测序技术的广泛应用加速了微小核糖核酸（Micro-ribonucleic acid，miR）的研究［8］。miR 作为非编码RNA 的一种类型，已被证实具有作为多种疾病生物标志物的潜力，并且近年来在多种疾病的早期诊断研究中得到广泛的应用［9］。在GDM 的研究中，已有报道显示miR-132-3p和miR-29a-3p［10］、miR-223［11］和miR-222-3p［12］等miR 可能具有预测GDM 发病风险的潜力。然而，这些miR 的实际应用价值仍需进一步验证，而且在妊娠过程中存在大量尚未被报道的miR，这些miR 对于预测GDM 发病风险的潜力有待探索和确认。因此，本研究旨在探索具有潜在预测价值的miR，以提供早期预测GDM 发病风险的新思路。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2021 年6 月30 日至2022 年6 月30 日在莆田市第一医院登记的5 例确诊为GDM 的汉族孕妇及5 名正常健康孕妇，分别作为患者组和对照组。对照组的纳入标准包括不存在其他妊娠期并发症和无GDM 家族史等；排除标准为患有GDM。患者组纳入标准：①妊娠时间为24～28 周及28 周后首次就诊者；②口服葡萄糖耐量试验所得结果为空腹血糖值≥5.10 mmol/L 和（或）餐后1 小时血糖≥10.00 mmol/L 和（或）餐后2 小时血糖≥8.50 mmol/L。患者组排除标准：①空腹血糖≤4.40 mmol/L；②妊娠前患糖尿病、肾病、高血压、系统性红斑狼疮、血栓性疾病等疾病。本研究已获得院伦理委员会的批准，并已取得所有患者签署的知情同意书。

1.2 GDM 患者中miR 异常表达的研究

1.2.1 分组及样本采集

将10 名研究对象分为GDM 组以及正常对照组。从每位研究对象身上提取5 mL 外周血样本，用于RNA 提取、测序和分析。

1.2.2 miR 表达谱分析

使用Trizol 总RNA 提取试剂盒（赛默飞世尔科技公司）提取外周血样本的总RNA。取出5 μg RNA 作为模板，使用RNA 反转录试剂盒（赛默飞世尔科技公司）合成cDNA，并将其送往上海美吉生物医药科技有限公司进行测序和分析，并获得所有miR 的表达谱信息。

1.2.3 miR 筛选

通过生物信息学方法，对本研究测序数据、GSE218696 和GSE192813 两个公开数据集进行交叉分析，筛选出在这三个数据集中具有显著表达差异且有交集的异常表达miR。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 研究对象基础资料分析

患者组的餐后1 小时血糖显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组在年龄、空腹血糖、身高、孕前体重与孕前体质指数（Body mass index，BMI）、甘油三酯、高密度脂蛋白和胆固醇等指标之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组研究对象基线资料［（），M（IQR）］Table 1 Baseline data of two groups［（），M（IQR）］

表1 两组研究对象基线资料［（），M（IQR）］Table 1 Baseline data of two groups［（），M（IQR）］

注：a 代表该变量不满足正态性，采用非参数检验进行组间比较，Z 为秩和检验的统计量。

2.2 GDM患者中异常表达miR的鉴定及其表达水平

测序数据经过清洗和基因组比对，覆盖率良好，真实性高。进一步统计得出每个样本中的已知和新miR 数目。见表2。

表2 各样品miR 统计结果Table 2 miR counts for each sample

2.3 差异表达miR 的数据集验证

两组之间共有229个差异表达miR，其中，114个miR 上调，115 个miR 下调。聚类分析和已知的miR数据集的交叉比对结果显示，miR-326和miR-532-3p均具有较高的表达差异，并且重复性较好。miR-326和miR-532-3p在患者组中的表达量均显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3、图1。

图1 miR-326 和miR-532-3p 在本研究数据集两组间表达量Figure 1 Expression of miR-326 and miR-532-3p between two groups

表3 miR-326 和miR-532-3p 在两组中的表达量Table 3 Expression of miR-326 and miR-532-3p between two groups

2.4 miR 及各变量的相关性分析

在患者组以及对照组中，miR-326和miR-532-3p的表达量互相之间存在显著的正相关关系（r=0.87，P＜0.05），并且两者与餐后1 小时血糖呈正相关关系（r=0.71、0.70，P均＜0.05）。此外，餐后2 小时血糖与年龄呈正相关关系（r=0.64，P＜0.05），而胆固醇水平与甘油三酯水平之间呈较强的正相关关系（r=0.68，P＜0.05）。见图2。

图2 各变量之间相关性矩阵图Figure 2 Correlation diagram between variables

2.5 miR-326 和miR-532-3p 单独检测对GDM 发病风险的预测价值

根据阳性与阴性样本的检测和最终诊断的结果，设置miR-326和miR-532-3p的阳性临界值分别为6.86 和28.40，此时miR-326的灵敏度为1.00，特异度为0.80；miR-532-3p的灵敏度为1.00，特异度为0.80。见表4。ROC 分析结果显示，miR-326和miR-532-3p预测GDM 发病风险的曲线下面积（Area under curve，AUC）均为0.96（95%CI：0.84～1.00，P＜0.05）。见图3。

图3 miR 预测GDM 发病风险的ROC 曲线图Figure 3 ROC graph of miR diagnostics GDM

表4 miR-326 和miR-532-3p 不同阳性临界值对应性能指标表Table 4 Performance index table corresponding to different positive critical values of miR-326 and miR-532-3p

2.6 血清miR-326 和miR-532-3p 联合检测对GDM 发病风险的预测价值

当使用miR-326和miR-532-3p联合检测时，其灵敏度为1.00，特异度为0.80，准确性为0.80，阳性预测值为0.71，阴性预测值为1.00。见表5。

表5 miR-326 和miR-532-3p 联合预测妊娠期糖尿病发病风险四格表Table 5 Diagnosis efficiency of gestational diabetes mellitus by combined detection of miR-326 and miR-532-3p

3 讨论

miR 被认为是预测GDM 发病风险最理想的生物标志物之一，然而其在大规模的临床验证方面的能力仍需进一步研究，而且大量未知的miR在预测GDM 发病风险方面的价值仍有待探究。因此，本研究通过分析孕妇外周血中的RNA，并运用转录组测序技术，发现miR-326和miR-532-3p在患者组与对照组中的表达差异显著，提示其与GDM 的发生存在密切关系。进一步分析显示，miR-326和miR-532-3p能够有效区分患者组和对照组，并具有较高的敏感性和特异性。

餐前及餐后的血糖数值反映了胰岛素抵抗和胰岛β 细胞功能衰退的程度。本研究发现，餐后1小时血糖水平与miR-326和miR-532-3p的表达呈正相关关系，提示其可能与胰岛素抵抗状态相关。miR-326基因定位于ARRB基因内含子上，已有研究表明miR-326与自身免疫疾病有关，如多发性硬化症、系统性红斑狼疮、免疫性血小板减少症和1 型糖尿病等［13］。Sebastiani 等［12］研究发现，miR-326在具有持续胰岛自身免疫的1 型糖尿病患者中表达水平更高，并且与疾病的严重程度密切相关［14］。然而，miR-326与2 型糖尿病或GDM 的关系仍需进一步研究。本研究首次发现miR-326在GDM 患者中高表达，并能够区分GDM 患者和健康孕妇，提示miR-326在GDM 的发病中可能起到一定作用。至于miR-532-3p，在GDM 方面的研究相对较少，主要集中在糖尿病肾病和慢性肾病等领域。Esteves 等［15］的研究表明，糖尿病患者中miR-532-3p的表达水平下调。此外，GLUT4基因与miR-532-3p的表达呈正相关关系，提示miR-532-3p可能是GLUT4基因表达变化的标志物，而GLUT4基因编码的葡萄糖转运蛋白4 功能异常会导致胰岛素信号传导失效，从而引发GDM 的发生［16］。这表明miR-532-3p的变化可能通过GLUT4基因间接参与了GDM 的发生，但相关机制仍需进一步研究。值得注意的是，miR-326和miR-532-3p在预测GDM 发病风险方面的性能高度一致，这可能部分归因于样本量不足。此外，本研究结果显示，miR-326和miR-532-3p的联合预测能力强，提示外周血中的miR326和miR-532-3p有望作为潜在的GDM 预测生物标志物，但仍需要进一步扩大样本量并进行长期随访研究以证实其效果。

综上所述，miR-326和miR-532-3p可能参与了GDM 的发生和发展，进一步研究这两个miR 在预测GDM 发病风险和疾病机制方面具有重要的意义。本研究发现miR-326和miR-532-3p在真实的临床患者和健康对照中表达差异显著，并具有预测GDM 发病风险的潜力，为GDM 的预测提供了新的思路和方法。