lncRNA MAGI2-AS3靶向调控miR-130a-5p对柯萨奇病毒B3诱导的大鼠心肌细胞H9C2损伤的影响

朱康宁,郑培明,高 岚

河南省人民医院检验科 郑州 450003

病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由病毒感染所致的一种心肌局限性/弥漫性病变,发病率逐年上升[1]。部分患者会出现心力衰竭等心肌损害,已知柯萨奇病毒B3(coxsackie virus B3,CVB3)是VMC常见病毒株[2]。CVB3感染可引起炎症、细胞凋亡、氧化应激等,进而引起心肌细胞损伤[3]。长链非编码RNA(lncRNA)长度超过220 nt,可竞争性结合miRNA,降解靶基因,抑制靶基因表达,参与心肌细胞损伤[4]。lncRNA MAGI2-AS3在1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的神经细胞中高表达,干扰其表达可抑制MPP+诱导的神经细胞凋亡及氧化应激,促进细胞增殖[5]。但MAGI2-AS3在VMC心肌细胞损伤中的作用机制尚不清楚。StarBase预测显示MAGI2-AS3与miR-130a-5p存在结合位点。研究[6]表明,miR-130a-5p在心肌缺血再灌注损伤中低表达,过表达miR-130a-5p可减轻心肌缺血再灌注损伤。本研究主要探讨MAGI2-AS3是否靶向miR-130a-5p,进而调控CVB3诱导的大鼠心肌细胞损伤。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒与试剂上海语纯生物科技有限公司提供大鼠心肌细胞H9C2;武汉博威德生物技术有限公司提供CVB3(Nancy株);上海西唐生物科技有限公司提供TNF-α、IL-6检测试剂盒;上海经科化学科技有限公司提供凋亡检测试剂盒;美国Promega公司提供细胞荧光素酶活性检测试剂盒;美国Thermo公司提供Trizol试剂;北京天根生化科技有限公司提供miRNA提取、反转录、SYBR荧光定量检测试剂盒;上海生工生物工程技术服务有限公司提供空质粒(pcDNA)、MAGI2-AS3过表达载体(pcDNA-MAGI2-AS3);广州市锐博生物科技有限公司提供阴性对照短发夹RNA(sh-NC)和MAGI2-AS3短发夹RNA(sh-MAGI2-AS3)慢病毒、miR-130a-5p寡核苷酸模拟物(miR-130a-5p mimic)及其阴性对照(miR-NC)、miR-130a-5p特异性抑制剂(抗miR-130a-5p)及其阴性对照(抗miR-NC);美国Abcam公司提供Bcl-2、GAPDH、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-Caspase-3)抗体。美国Thermo公司提供细胞培养箱;美国BD公司提供FACS Calibur流式细胞仪;美国Applied Biosystems公司提供ABI实时荧光定量PCR仪。

1.2 实验分组对照组:用不含药物、病毒的DMEM处理H9C2细胞48 h。CVB3组[7]:用含有100倍半数组织培养感染剂量(TCID50)CVB3的DMEM处理H9C2细胞48 h。CVB3+sh-NC组:H9C2细胞感染sh-NC慢病毒48 h后,用含有100倍TCID50CVB3的DMEM处理48 h。CVB3+sh-MAGI2-AS3组:H9C2细胞感染sh-MAGI2-AS3慢病毒48 h后用含有100倍TCID50CVB3的DMEM处理48 h。CVB3+miR-NC组:H9C2细胞转染miR-NC 48 h后,用含有100倍TCID50CVB3的DMEM处理48 h。CVB3+miR-130a-5p组:miR-130a-5p mimic转染H9C2细胞48 h后,用含有100倍TCID50CVB3的DMEM处理48 h。sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组:sh-MAGI2-AS3、抗miR-NC共转染至H9C2细胞48 h后收集细胞,用含有100倍TCID50CVB3的DMEM处理48 h。sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组:sh-MAGI2-AS3、抗miR-130a-5p共转染至H9C2细胞48 h后收集细胞,用含有100倍TCID50CVB3的DMEM处理48 h。每组3个复孔,实验重复3次。

1.3 细胞中MAGI2-AS3、miR-130a-5p表达的检测Trizol试剂、miRNA提取试剂盒用于提取细胞总RNA,按照反转录试剂盒合成cDNA,以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增。反应体系:10×PCR Buffer 2.5 μL,MgSO42.5 μL,dNTP 2.5 μL,上下游引物各0.5 μL,cDNA 2 μL,无RNase的ddH2O补足至25 μL。MAGI2-AS3上游引物5’-CAAGAAACAG CAACACCAGAAG-3’,下游引物5’-TAAGGTC CCCATTCAAGTCAGT-3’;miR-130a-5p上游引物5’-TCGAATCTAGAGATCCGACGCCGC-3’, 下游引物5’-GACGTGTAAACATCCTACACTCAGCT-3’;内参GAPDH上游引物5’-AACGGATTTGGTCGTAT TG-3’,下游引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.4 细胞凋亡率的检测胰蛋白酶消化细胞,取1 mL细胞悬液(5×105个/mL)离心5 min(3 000 r/min),预冷PBS洗涤沉淀,分别加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI,避光孵育15 min(37 ℃),1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 细胞培养上清中TNF-α、IL-6分泌水平的检测取细胞培养上清,ELISA法检测TNF-α、IL-6分泌水平,按照试剂盒说明书操作。

1.6 MAGI2-AS3与miR-130a-5p靶向关系的检测分子克隆法分别构建含有结合位点的野生型载体(WT-MAGI2-AS3)、含有突变位点的突变型载体(MUT-MAGI2-AS3),脂质体转染法分别将WT-MAGI2-AS3与miR-NC、WT-MAGI2-AS3与miR-130a-5p mimic、MUT-MAGI2-AS3与miR-NC、MUT-MAGI2-AS3与miR-130a-5p mimic共转染未处理的H9C2细胞,采用试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.7 细胞中Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白表达的检测细胞加入RIPA裂解液提取总蛋白,BCA法检测蛋白浓度,取40 μg蛋白进行SDS-PAGE,分离蛋白后转膜,50 g/L脱脂牛奶封闭2 h,加入1∶1 000稀释的Bcl-2、Cleaved-Caspase-3一抗,4 ℃孵育24 h,加入1∶3 000稀释的二抗,37 ℃孵育2 h,Quantity One软件对蛋白条带进行定量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参条带灰度值。

1.8 统计学处理采用SPSS 21.0分析数据。两组间MAGI2-AS3、miR-130a-5p相对表达量、凋亡率,Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白相对表达量,TNF-α、IL-6分泌水平,双荧光素酶报告实验结果的比较采用两独立样本t检验;多组间上述指标的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 对照组与CVB3组心肌细胞中MAGI2-AS3和miR-130a-5p相对表达量比较与对照组比较,CVB3组MAGI2-AS3相对表达量升高,miR-130a-5p相对表达量降低,见表1。

表1 对照组与CVB3组心肌细胞中MAGI2-AS3和miR-130a-5p相对表达量比较(n=3)

2.2 对照组、CVB3组、CVB3+sh-NC组、CVB3+sh-MAGI2-AS3组心肌细胞凋亡及细胞损伤相关指标比较与对照组比较,CVB3组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,TNF-α、IL-6分泌水平升高;与CVB3+sh-NC组比较,CVB3+sh-MAGI2-AS3组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高,TNF-α、IL-6分泌水平降低。见图1、表2。

1:对照组;2:CVB3组;3:CVB3+sh-NC组;4:CVB3+sh-MAGI2-AS3组

表2 4组心肌细胞lncRNA MAGI2-AS3表达、凋亡及细胞损伤相关指标的比较(n=3)

2.3 MAGI2-AS3与miR-130a-5p的靶向关系MAGI2-AS3与miR-130a-5p存在互补序列,见图2。双荧光素酶报告实验结果见表3。上述结果提示两者存在靶向关系。

图2 MAGI2-AS3与miR-130a-5p的靶向关系

表3 双荧光素酶报告实验结果(n=3)

2.4 CVB3+miR-NC组与CVB3+miR-130a-5p组心肌细胞凋亡、细胞损伤相关指标比较与CVB3+miR-NC组比较,CVB3+miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平及TNF-α、IL-6分泌水平降低,而Bcl-2蛋白表达水平升高,见图3、表4。

图3 CVB3+miR-NC组(1)、CVB3+miR-130a-5p组(2)心肌细胞Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达

表4 CVB3+miR-NC组、CVB3+miR-130a-5p组心肌细胞miR-130a-5p表达、凋亡及细胞损伤相关指标的比较(n=3)

2.5 sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组与sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组心肌细胞凋亡、细胞损伤相关指标比较与sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组比较,sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平以及TNF-α、IL-6分泌水平升高,而Bcl-2蛋白表达水平降低,见图4、表5。

图4 sh-MAGI2-AS3+抗miR-NC组(1)与sh-MAGI2-AS3+抗miR-130a-5p组(2)心肌细胞Bcl-2、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达

表5 2组心肌细胞miR-130a-5p表达、凋亡及细胞损伤相关指标比较(n=3)

3 讨论

VMC小鼠心肌细胞中MEG3水平升高,miR-223表达降低,下调MEG3表达或上调miR-223可增加小鼠存活率,抑制心肌炎症[8]。敲除MALAT1可减轻CVB3诱导的小鼠急性VMC[9]。AK085865表达上调可促进VMC发生[10]。目前VMC发病机制尚未明确,已知lncRNA与VMC发生发展密切相关,因而需探寻VMC发展相关lncRNA,为揭示其发病机制奠定实验基础。MAGI2-AS3在阿尔茨海默症患者小脑[11]、细胞模型[12]中表达增加,下调其表达可增强小鼠神经元活性、抑制神经炎症反应。MAGI2-AS3过表达可调节髓核细胞中Fas配体表达,参与椎间盘退变发展过程[13]。本研究结果显示,感染CVB3后H9C2细胞凋亡率、Cleaved-Caspase-3蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,与江振涛等[14]研究结果相似。本研究发现,CVB3诱导的H9C2细胞中MAGI2-AS3表达水平升高,沉默MAGI2-AS3可降低CVB3诱导的H9C2细胞凋亡率,抑制凋亡相关蛋白表达;同时细胞TNF-α、IL-6分泌水平降低,与肖文涛等[15]研究结果相似,提示沉默MAGI2-AS3可抑制炎症反应,进而减轻CVB3诱导的H9C2细胞炎症损伤,抑制细胞凋亡。

本研究证实MAGI2-AS3可靶向结合miR-130a-5p。研究[16]表明,miR-130a-5p在血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞损伤中表达降低。miR-130a-5p在慢性缩窄性损伤大鼠、脂多糖诱导的星形胶质细胞中表达下调[17]。miR-130a-5p在小鼠神经性疼痛模型中表达下调,上调其表达可抑制星形胶质细胞活化,抑制炎症反应,减轻神经性疼痛,其作用机制与抑制NF-κB通路有关[18]。本研究结果显示,CVB3诱导的H9C2细胞中miR-130a-5p表达下调,抑制其表达可减弱沉默MAGI2-AS3对CVB3诱导的H9C2细胞凋亡、炎症反应的抑制作用。提示MAGI2-AS3可竞争性结合miR-130a-5p,调节H9C2细胞凋亡,控制炎症因子生成、释放,进而促进CVB3诱导的H9C2细胞损伤。

综上所述,沉默lncRNA MAGI2-AS3可通过靶向结合miR-130a-5p而抑制H9C2细胞凋亡、炎症反应,进而减轻CVB3诱导的H9C2细胞损伤,MAGI2-AS3/miR-130a-5p可能作为VMC治疗的潜在靶点。但miR-130a-5p调控下游靶基因表达的可能作用机制尚需进一步探究。