以COL4A5基因突变为主Alport综合征临床分析

刘益男 张永桃 余韶卫 罗立荣 黄逸辉 于生友 于力

1暨南大学附属广州红十字会医院儿科（广州 510220）；2广州市第一人民医院儿科（广州 510180）

Alport综合征（Alport syndrome AS）是以血尿和（或）蛋白尿起病，伴随肾功能进行性减退联合感音神经性耳聋和视网膜异常等肾外损害，极少数患者可伴有平滑肌瘤为主要临床表现的基因病，又称遗传性肾炎［1］。该疾病以合成Ⅳ型胶原链上的COL4A3、COL4A4、COL4A5基因突变为主，其中COL4A5基因突变通常称为X连锁显性遗传性肾炎（X-linked Alport syndrome，XLAS），该突变类型占AS患者的85%，其临床、病理表现及其预后均较COL4A3、COL4A4基因突变更为严重。研究表明COL4A5的致病变异体越来越多地出现在有蛋白尿（肾病综合征肾炎型、激素耐药型肾病综合征）或有肾活检发现的局灶性节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）的个体中［2］。该病起病隐匿，临床表现多样，病理表现不典型因此临床上易出现漏诊、误诊等现象，目前AS的治疗尚无特异性治疗药物，若未及时诊断及干预，临床结局通常以临床终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）结束［1，3］，最终以血液透析、肾移植治疗，早期诊断并及时干预AS有很大的益处。本研究经二代基因测序检测为COL4A5基因突变患儿临床表型与基因之间的关系进行相关分析，探讨临床表型和基因突变类型的特点，以提高对COL4A5基因突变的再认识。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2016年4月至2023年4月期间在医院因血尿和（或）蛋白尿查因就诊后经二代测序发现COL4A5基因突变最终确诊为Alport综合征的32例患儿临床资料，根据入选标准及剔除标准对样本进行筛选，入选标准：（1）年龄＜18岁；（2）患儿均符合AS诊断标准［3］；（3）行基因检测后明确诊断为COL4A5突变XLAS患儿。排除标准：（1）年龄≥ 18岁；（2）合并严重多器官功能障碍患儿；（3）患者被诊断为常染色体隐性遗传或缺乏XLAS诊断证据。（4）病史资料不全者。本研究经暨南大学附属广州红十字会医院伦理委员会批准（批件号：穗红医院伦审2023-115-01）和广州市第一人民医院伦理委员会批准（批件号：K-2020-064-01），所有患儿监护人均已签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 临床资料选择COL4A5基因突变确诊为Alport综合征32例患儿的临床资料，包括性别、年龄、起病年龄、起病方式、家族史、并发症、就诊时尿常规红细胞（个/μL）、白蛋白（g/L）、24 h尿蛋白定量（mg/24 h）、血肌酐（umol/L）、尿素氮（mmol/L）、视力及裂隙灯散瞳眼底等检查、听力筛查、胡桃夹B超等检查结果。

1.2.2 病理资料收集并整理COL4A5基因突变患儿肾脏活检组织光镜（HE、PAS、PASM、Masson染色）、免疫荧光（IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q、HBsAg）、电镜结果，其中21例在B超引导下行经皮穿刺肾活检术，11例未完善该检查。

1.2.3 基因检测征得患儿或父母知情同意后，采取患儿及父母的外周血2 mL，提取DNA，运用二代测序技术（广州嘉检验中心）进行基因检测。提取患儿及父母DNA，并扩增建立含目标基因的全外显文库，利用液相捕获目标基因，然后高通量测序，找出致病基因，用Sanger测序验证患儿父母相应的突变，筛选出COL4A5基因突变阳性患儿32例，根据美国医学遗传学与基因组学会联合美国分子病理学会指定的基因序列变异的解释标准与指南进行致病性分析，包含参考序列、变异位点、变异对核酸序列及对编码蛋白质的改变等，并用预测软件（uniprot，https：//www.uniprot.org/）预测评估序列变异对基因功能的影响。

1.3 统计学方法使用SPSS 25.0软件进行统计学分析，正态分布计量资料采用均数±标准差表示，非正态分布资料以M（P25，P75）来表示，计数资料以例（%）表示。百分率比较采用χ2检验，如样本量N＜40或χ2检验的结果在临界状态时采用Fisher's精确概率法，单向有序组间资料比较采用Kruskal-Wallis秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较32例患儿中男性患儿16例，女性患儿16例，男女比例为1∶1，患儿起病年龄为1～10岁，其中男性患儿平均起病年龄为（3.56 ±2.72）岁，女性患儿平均起病年龄为（3.81 ± 1.90）岁。确诊XLAS的患儿年龄为（4.83 ± 2.12）岁，＜5岁者10例（31.25%），≥ 5岁且＜10岁者18例（56.25%），≥ 10岁者4例（12.5%）。按起病方式可分为：（1）以孤立性血尿起病12例（37.5%）；（2）以血尿＋蛋白尿起病8例（25%）；（3）以肾病综合征肾炎型起病12例（37.5%）。患儿家族中直系亲属有尿常规或肾功能异常者有11例（34.4%），家族史阴性21例（65.6%）。患儿合并胡桃夹综合征6例（18.75%），患儿初诊时诊断为肾病综合征肾炎型12例（37.5%）。肾外表现耳部病变的发生率高于眼部病变，眼部病变白内障3例（9.37%），耳部病变感音性神经性耳聋6例（18.75%），其中3例患儿（50%）发生肾衰，后期随访发现7例（21.87%）患儿已肾衰竭，7例患儿发展为ESRD的平均年龄为（15.66 ± 4.41）岁，其中女性患儿5例（71.42%），男性患儿2例（28.57%）。见表1。

表1 32例AS患儿临床资料特点分析Tab.1 Characterization of clinical data of 32 children with AS 例（%）

2.2 肾脏病理光镜：局灶节段性肾小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）2例（9.52%）；系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative glomerulonephritis，Ms PGN）11例（52.38%）；微小病变（minimal change disease，MCD）8例（38.09%）。免疫荧光阴性17例（80.95%）；IgA沉积4例（19.04%）。电镜：基底膜变薄（弥漫性或节段性）13例（61.9%）；基底膜厚薄不均8例（38.09%）。

2.3 基因检测32例患儿均行第二代基因检测，基因突变类型分为错义突变12例（37.5%）、剪切位点突9例（28.12%）、无义突变6例（18.75%）、缺失突变3例（9.37%）、移码突变2例（6.25%）。后期随访中发现7例（21.87%）肾衰竭患儿，错义突变4例（57.14%），剪切位点突变2例（28.57%），无义突变1例（14.28%）；自发突变10例（27.02%），其中女性患儿8例（80%），男性患儿2例（20%）；遗传突变22例（68.75%），其中19例（85%）遗传于母亲，男性患儿15例（76.47%），女性患儿4例（23.52%）；3例（9.37%）遗传于父亲，均为女性患儿，后期随访中发现其中2例女性患儿已进入ESRD阶段。基因检测结果，见表2。

表2 32 例XLAS患儿基因检测结果Tab.2 Genetic testing results of 32 children with XLAS

3 讨论

Alport综合征是编码胶原IVα3、α4、和α5链的基因COL4A3、COL4A4、COL4A5突变，导致这些链不能形成α3α4α5异源三聚体，不能构成肾小球、耳朵和眼睛基底膜的主要组成部分，当编码这些链的3个基因中的任何一个发生突变时，α3α 4α5胶原网络在肾小球基底膜（Glomerular basement membrane，GBM）中的正确折叠与组装就会受损：它变得非常容易受到过滤压力的影响，并最终受到不可逆的损伤，从而出现与GBM损伤相关的临床特征［4］。Alport综合征的遗传方式对肾脏预后有很大影响，以COL4A5基因突变导致的X连锁Alport综合征发病率最高，约占85%，该基因突变为主的AS临床症状及病理表现较以COL4A3、COL4A4突变为主的AS更为严重，研究表明这可能与以下因素相关：（1）COL4A5基因位于X染色体上，携带该致病基因，是诊断XLAS遗传性肾炎的条件；（2）COL4A5编码区域位于Ⅳ型胶原蛋白中心1/3处，中心区域具有重要的结构和功能，而COL4A3和COL4A4编码区域位于两端，即使突变对于Ⅳ型胶原蛋白合成影响相对较小；（3）COL4A5在肾小球的表达量比COL4A3和COL4A4更高，综上机制可能会导致COL4A5突变后肾小球基底膜损伤更严重。1989年POCHET等的临床研究首次表明常染色体显性遗传的男性患者的中位肾脏生存期比X连锁染色体的患者长25年，GIBSON等［5］描述男性通常在30岁前出现肾功能衰竭，同时伴有听力损失和眼部异常，女性具有更多样的表型，通常受影响较小，在60岁时，高达20%的女性出现肾衰竭。2022年SAVIGE等［6］报道表明COL4A3和COL4A4杂合变异（常染色体显性Alport综合征）症状较轻，通常与终末期肾衰竭、听力损失或眼部异常无关，2023年ZHOU等［7］纳入126例中国AS患儿，表明COL4A5基因突变相较于COL4A3、COL4A4突变在临床中的症状更重，预后更差，很快可出现肾外表现及进展至ESRD阶段。临床上对COL4A5基因突变引起的XLAS高度重视，根据2021版国外Alport综合征的基因检测和管理指南［8］明确提出所有男性XLAS患者确诊时即启动血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）治疗，女性XLAS患者在出现微量蛋白尿、高血压和肾功能减退时即启动ACEI治疗。

正常肾小球基底膜是完整连续的，厚度均匀一致，是构成肾小球滤过机械屏障的重要组成成分，诊断AS在基因检测尚未普及时肾脏电镜病理是非常重要的手段，根据我国2023最新版指南共识［1］。Alport综合征的金标准是电镜下肾小球基底膜极不规则、弥漫性变薄或增厚，或厚薄及密度不均、致密层撕裂分层、篮网状改变。KAMENETSKY等［9］发现在AS的早期或轻度病例中，基底膜变薄可能是主要特征，本组资料中13例患儿电镜结果表现为基底膜变薄或厚薄不均，这与该结论一致；在本研究中行肾脏穿刺的患儿中光镜结果显示通常表现为Ms PGN、微小病变、FSGS这3种病理形式，对于免疫荧光而言，沉积IgA的病例相对较多，该研究的电镜表现可能与疾病诊断早，病理尚未进展至经典表现相关，因此对于诊断儿童AS，早期单靠肾穿刺活检确诊特异性不高，相较于肾脏穿刺，基于有创程度及特异性而言，基因检测似乎是更好的选择。

COL4A5基因突变有多种类型，常见的分类形式为错义突变及非错义突变，错义突变临床表现较轻微，预后一般较好，而非错义突变可分为移码突变、缺失突变、无义突变、剪切位点突变等，本组资料中错义突变12例，剪切位点突变9例，为常见突变类型，这和HERTZ等［10］、谭俊杰等［11］临床报道结果相似，2019年NOZU等［12］研究表明发生肾功能衰竭的概率依次为移码突变、缺失突变、剪切位点突变、错义突变，其主要是依据这些突变形式会导致蛋白在转录及翻译过程中降低信使核糖核酸水平，出现截短蛋白，导致Ⅳ胶原蛋白结构和不完整从而影响功能，因此非错义突变的临床表现及预后较错义突变差，更容易导致肾移植结局［13］。这与本研究结论不一致，本研究中，7例患儿后期出现肾功能衰竭表现，但错义突变比例明显高于其他突变类型，且进入ESRD的年龄明显偏小，这可能与总体样本量偏少及错义突变类型在本研究中占比例偏多有关，且XLAS的远期临床结局还受不同因素影响，比如突变位点的位置、突变位点所对应的蛋白质结构域、突变氨基酸的性质等因素相关，因此在解释这些结果时需考虑这些因素，但无论如何在临床中面对遗传或临床咨询时我们应谨慎对待错义突变类型，其预后也可能会更差。对于性别差异而言，TAN等［14］、BEKHEIRNIA等［15］的大样本临床研究均表明男性在该疾病中具有典型的临床表现，并与基因型之间呈强相关性，证实其临床表现、进展及预后男性均较女性严重，这不仅与雌激素可在一定程度上保护肾功能有关，而且与X染色体失活的不均匀模式（即偏斜的X染色体失能）相关［16］。JAIS等［17］发表了有关女性大样本基因型-临床表型相关性研究，纳入了195个家系，结果表明尽管男性肾功能衰竭的进展是持续的，但女性的肾功能衰竭过程变化跨度更大，总体而言大多数女性临床症状仍较轻，女性在40岁前患终末期肾病的概率为12%，而男性为90%。2022年GIBSON等［18］在PubMed和Scopus检索了过去20年的文献，提取了具有致病性杂合COL4A5变异体的366例女性的基因型和临床数据，结果表明决定XLAS女性患儿预后及严重程度的因素有蛋白尿的发生和逐渐增加，以及听力缺陷的发展。本研究有7例（21.87%）患儿疾病进展至ESRD，有5例（71.42%）是女性，其中4例（80%）患儿早期表现大量蛋白尿，本组资料进展至终末期肾病患儿的临床资料也验证了该因素，即在患有X连锁Alport综合征的女性患儿中，蛋白尿与更严重的基因型相关，是疾病严重程度和可能进展的指标［18］。

本组资料中患儿起病年龄小，病程短，早期缺乏特异性诊断依据，根据患儿临床中出现一系列肾内表现，疾病早期易误诊为肾病综合征肾炎型，后发现使用激素甚至加用免疫抑制剂进行治疗效果仍欠佳，随着病情进展，陆续出现肾外表现及肾功能进行性减退等表现，疑诊AS。肾病综合征肾炎型病理特点是免疫复合物可沉积于肾小球内，引起局部的免疫反应及损伤，而这种损伤会影响到COL4A5编码的α5链的正常表达和功能，党西强等［19］对313例患肾脏疾病儿童肾脏穿刺活检进行了相关分析，发现肾病综合征肾炎型的常见光镜表现为FSGS、Ms PGN、IgA肾病，这与本研究中AS患儿光镜表现相似。陈燕贞等［20］纳入了91例AS患儿进行回顾性分析发现45例误诊为其他疾病，而其中肾病综合征占比约40%，因此临床中对于难治性肾病综合征患儿必要时可完善基因检测排除AS可能。血尿作为第一临床表现，临床上对于持续性变形性镜下血尿及肉眼血尿的患儿，一定要引起足够重视，尽量明确病因，后续定期随访监测患儿病情变化，蛋白尿作为疾病进展的重要标志，若患儿以肾病综合征肾炎型起病且完善肾活检结合病史诊断仍未明确，应建议及时完善基因检测。

综上所述，遗传性肾炎COL4A5基因突变患儿起病时临床表现严重程度差异性较大，疾病早期经典的病理表现及肾外表现均尚未出现，加上新发变异提供的家族史尚不能为临床提供线索，给临床诊断带来一定难度，在初诊时易被误诊为肾病综合征肾炎型，予激素或免疫抑制剂进行治疗，从而耽误使用一线药物治疗的最佳时机，影响预后。因此建议积极完善基因检测以明确诊断，一经确诊应立即启动一线ACEI类的药物保守治疗蛋白尿；该基因突变性别之间异质性明显，男性临床表现更为典型，女性患儿临床表现跨度大，也需谨慎诊治；完善基因检测，注意突变类型，综合多种因素去判断预后，一旦确诊合理药物干预，延缓肾功能衰竭。