Mettl14介导的m6A修饰对改善心肌梗死的分子机制

郑学斌 沙莎 杨慧琼 刘恋

长沙市第四医院（湖南师范大学附属长沙医院）全科医学科（长沙 410006）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一个重大的公共卫生问题，随着治疗策略的改进，其病死率正在下降［1］。然而，在没有建立靶向治疗的情况下，与MI相关的心力衰竭仍然是一个主要问题。心肌梗死后心脏重塑是由左心室形状和功能的若干变化引起的，最终导致继发于心脏纤维化病理变化的心力衰竭［2］。作为真核信使RNA（mRNA）最丰富的化学修饰，已知N6-甲基腺苷（m6A）通过调节靶基因表达来影响各种基本的生物过程［3］。m6A水平的改变介导细胞凋亡、增殖、自我更新和发育［4］。然而，m6A甲基化在MI进展中的潜在作用仍有待进一步挖掘。甲基转移酶样14（methyltransferase-like 14，METTL14）是一种m6A写入蛋白，广泛参与了心血管发病机制等重大疾病的进展［5］。最近研究证实，METTL14在糖尿病性心肌病大鼠心肌组织中下调，其上调通过介导m6A修饰活性以NLRP3依赖性方式抑制心肌细胞焦亡［6］。然而，METTL14介导的m6A修饰是否调节MI及其潜在机制仍然未知。在这项研究中，我们探索了METTL14介导的m6A修饰在MI中的生物学作用，并揭示了METTL14可以作为一种新的预测生物标志物和治疗靶点来阻断MI的进展。

1 材料与方法

1.1 动物和分组处理4周大的雄性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有小鼠都喂食标准食物和水。实验小鼠维持在标准条件下［在（22 ± 2）℃ 恒温和60%湿度的房间内］，以12 h的昼夜循环为小鼠提供自由采食的食物和水。适应性喂养7 d，通过永久结扎左冠状动脉前降支（left anterior descending，LAD）构建MI小鼠模型［7］。假手术组进行相同的手术，但没有结扎LAD。将小鼠用于以下实验：实验1考察MI对小鼠心脏组织m6A修饰水平影响。将小鼠随机分为4组，每组10只：假手术组（Sham）、MI诱导后1 d组、4 d组和7 d组。实验2考察METTL14过表达对MI小鼠的改善作用。将小鼠随机分为4组，每组10只：Sham+AAV9-NC组、Sham+AAV9-METTL14组、MI+AAV9-NC组和MI+AAV9-METTL14组。各组小鼠分别在MI诱导前1周将AAV9-METTL14或AAV9-NC通过尾静脉注射到小鼠体内。MI诱导后4 d，收集心脏组织用于后续分析。动物实验经长沙市第四医院（湖南师范大学附属长沙医院）动物伦理委员会批准（批件号：XD-2020-12）。

1.2 AAV9介导的METTL14过表达AAV9基因组颗粒获自本元正阳基因技术有限公司。将METTL14克隆到AAV9载体（AAV9-METTL14）中，然后通过尾静脉注射到小鼠体内，滴度为每g体重0.5 × 1011个载体基因组（vg/g）。以相同的剂量和时间点注射对照AAV9载体（AAV9-NC）。

1.3 超声心动图使用带有MS400换能器的Vevo 2100回波在麻醉小鼠（3.0%异氟醚和1.0 L/min的O2流量）中进行二维超声心动图。计算了射血分数（%EF） 和缩短百分比（%FS）。

1.4 斑点印迹使用Trizol试剂（美国Invitrogen公司）从心脏样本和细胞中提取RNA。NanoDrop（美国Thermo Fisher Scientific公司）用于分析RNA质量。将RNA样品点样在尼龙膜上。然后将膜放入紫外交联剂中交联5 min。将膜置于5%脱脂牛奶中密封2 h，加入m6A一抗4 ℃孵育过夜。第2天，应用二抗孵育2 h。另一张膜用亚甲蓝染色作为对照。

1.5 心脏微血管内皮细胞（cardiac microvascular endothelial cells，CMECs）分离和分组处理根据先前的研究［8］，使用CD31偶联微珠从小鼠心肌组织中分离CMECs，并在内皮培养基（ECM，美国ScienCel公司）中培养。为了在体外刺激缺氧缺血微环境，对细胞进行去氧葡萄糖（oxygen-glucose deprivation，OGD）处理。CMECs在动态O2和CO2分室控制器Oxycycler C42（美国Biospherix公司）中于37 ℃下培养24 h，气体混合物由5% CO2和95% N2组成。将细胞分为以下两个实验：实验1考察考察OGD处理对CMECs中m6A修饰水平影响，将细胞分为NC组和OGD组，NC组在正常环境下培养，OGD组则进行OGD处理。实验2考察METTL14是否通过USP48对OGD诱导的CMECs细胞起保护作用，将细胞分为NC组、OGD组、OGD + SgNC组、OGD + METTL14KO组和OGD +METTL14KO + USP48组。除NC组外，其余组建立OGD模型。OGD + SgNC组、OGD + METTL14KO组和OGD + METTL14KO + USP48组在建立OGD模型前48 h分别用SgNC、METTL14KO或USP48过表达质粒转染细胞。

1.6 CRISPR/Cas9技术敲除CMECs中的METTL14我们设计了靶向METTL14的单向导RNA（METTL14KO） （http：//crispr.mit.edu）：mMETTL14-sgRNA：CGCTTCGCGAGAGATTGCA。sgRNA至少选择10～15个单克隆进行敲除检测。接下来，设计引物以扩增敲除的目标片段并送去测序。使用Lenti-V2-GFP病毒载体构建敲除病毒。

1.7 免疫荧光将心脏组织在/Tween-20封闭溶液中孵育1 h。然后将样品与一抗在4 ℃下孵育过夜，并在室温下与适当的荧光二抗孵育3 h。细胞核用DAPI染色。用LSM700激光扫描共聚焦显微镜（德国Carl Zeiss公司）捕获图像。免疫印迹的一抗如下：α-SMA （1∶500，英国Abcam公司）、CD31（1∶500，英国Abcam公司）和VE-Cadherin（1∶500，英国Abcam公司）。

1.8 ROS染色检测在等密度的6孔培养皿上铺板的CMECs中测量线粒体ROS水平［9］。细胞在37 ℃下用线粒体ROS指示剂MitoSOX™ Red（2 μmol/L，美国Invitrogen公司）染色15 min。使用LSM700激光扫描共聚焦显微镜获得细胞图像。

1.9 RNA-seq和数据分析在OGD处理24 h后，收集METTL14敲低细胞及其对照用于RNA-seq。通过Oligo dT富集总RNA样品，然后使用KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit（美国Illumina公司）构建文库。采用Illumina NovaSeq 6000仪器进行测序。根据Arraystar的标准方案进行小鼠m6AmRNA表观转录组微阵列样品制备和微阵列杂交。

1.10 蛋白质印迹将从组织和细胞中收集的蛋白通过10%～15% SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上。将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。次日，将膜与二抗一起孵育1 h，使用增强的化学发光试剂（美国Millipore Sigma公司）观察免疫反应条带。研究使用的一抗和二抗购自英国Abcam公司。以β-actin作为内源性参考，使用Image J软件对蛋白质进行量化。

1.11 统计学方法所有结果均以平均值 ± 标准差表示。使用SPSS 25.0软件进行统计分析。应用单向方差分析进行多重比较，组间两两比较使用Student-Newman-Keuls事后检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MI和OGD诱导m6A修饰异常心脏组织RNA m6A修饰水平在MI诱导后4 d和7 d高于Sham组（图1A）。MI诱导后1、4、7 d，METTL14表达降低，METTL3表达升高；其他酶（KIAA1429、WTAP、ALKBH5和FTO）没有明显变化（图1B），此外，在OGD诱导的CMECs细胞中检测到RNA m6A修饰水平高于NC组，并且METTL14表达降低（图1C、D）。

图1 MI和OGD诱导m6A修饰异常Fig.1 Abnormal m6A modification induced by MI and OGD

2.2 METTL14上调改善MI小鼠的微血管损伤和心脏功能小鼠在接受心肌MI损伤或假手术前，通过尾静脉注射AAV9-METTL14上调心脏组织中METTL14（图2A）。与Sham+AAV9-NC组相比，MI +AAV9-NC组小鼠心脏组织中血管内皮连接蛋白VE-cadherin表达显著下调（P＜0.05）。MI+AAV9-METTL14组小鼠心脏组织中VE-cadherin表达较MI +AAV9-NC组显著上调（P＜0.05）（图2B）。MI+AAV9-METTL14组的射血分数显著高于MI+AAV9-NC组（P＜0.05），和左心室尺寸低于MI +AAV9-NC组（P＜0.05）（表1）。

表1 MI后各组小鼠超声心动图参数和心脏/体重的差异Tab.1 Differences of Echocardiographic Parameters and Heart/Weight of Mice in Different Groups after MI ±s

表1 MI后各组小鼠超声心动图参数和心脏/体重的差异Tab.1 Differences of Echocardiographic Parameters and Heart/Weight of Mice in Different Groups after MI ±s

注：BW，体重；HW，心脏重量；LVDd，左心室舒张期尺寸；LVDs，左心室收缩尺寸；IVS，室间隔厚度；PW，后壁厚度；PW，后壁厚度；FS，左心室缩短率；HR，心率；与Sham+AAV9-NC组比较，*P＜0.05；与MI +AAV9-NC组比较，#P＜0.05

P值0.632＜0.001＜0.001 0.315＜0.001＜0.001＜0.001 0.426＜0.001＜0.001参数BW（g）HW（mg）HW/BW（mg/g）HR（次/min）LVDd（mm）LVDs（mm）IVS（mm）PW（mm）FS（%）EF（%）Sham+AAV9-NC组26.0 ± 1.0 156.4 ± 7.8 6.04 ± 0.33 451.7 ± 12.5 3.25 ± 0.14 2.24 ± 0.09 0.82 ± 0.03 0.77 ± 0.05 32.7 ± 1.5 61.3 ± 2.7 Sham+AAV9-METTL14组26.1 ± 0.8 154.2 ± 8.3 5.94 ± 0.58 462.2 ± 14.1 3.31 ± 0.12 2.20 ± 0.11 0.81 ± 0.02 0.76 ± 0.04 33.1 ± 1.2 62.1 ± 2.4 MI +AAV9-NC组25.9 ± 0.7 237.6 ± 1.2*9.27 ± 0.75*477.4 ± 18.1 3.96 ± 0.16*3.15 ± 0.18*0.70 ± 0.03*0.79 ± 0.03 21.3 ± 2.3*44.6 ± 4.8*MI+AAV9-METTL14组25.9 ± 0.9 186.4 ± 9.6#7.15 ± 0.66#465.3 ± 17.4 3.57 ± 0.13#2.56 ± 0.13#0.78 ± 0.04#0.78 ± 0.02 29.4 ± 2.1#58.2 ± 4.5#F值0.89 28.50 8.24 1.75 7.55 20.22 10.77 1.20 17.94 14.65

图2 METTL14上调改善MI小鼠的微血管损伤Fig.2 Up-regulation of METTL14 improves microvascular injury in MI mice

2.3 METTL14上调减轻MI诱导的内皮线粒体功能障碍与Sham+AAV9-NC组小鼠相比，在MI+AAV9-NC组小鼠中观察到线粒体长度显著缩短（P＜0.05），片段化线粒体的形成显著增加（P＜0.05），同时伴随线粒体ROS水平显著增加（P＜0.05）。AAV9-METTL14抑制了MI诱导的内皮线粒体功能障碍（图3）。

图3 METTL14上调减轻MI诱导的内皮线粒体功能障碍Fig.3 Up-regulation of METTL14 alleviates MI-induced endothelial mitochondrial dysfunction

2.4 METTL14介导USP48 mRNA的m6A修饰METTL14敲低显著影响CMECs细胞基因的表达（图4A）。6个转录本在RNA-seq和表观转录组微阵列数据中重叠。将这6个转录本与MI心脏组织的RNA-seq进行了比较。结果发现只有USP48降低，m6A甲基化水平受METTL14显著调节并影响其表达（图4B）。与Sham+AAV9-NC组相比，MI+AAV9-NC组小鼠心脏组织中USP48表达显著下调（P＜0.05）。MI+AAV9-METTL14组小鼠心脏组织中USP48表达较MI +AAV9-NC组显著上调（P＜0.05）（图4C）。

图4 METTL14介导的USP48 mRNA的m6A修饰Fig.4 m6A modification of USP48 mRNA mediated by METTL14

2.5 METTL14通过USP48对OGD诱导的CMECs细胞起保护作用与NC组相比，在OGD组CMECs细胞中观察到线粒体ROS水平显著增加（P＜0.05），同时伴随着VE-cadherin表达水平显著降低（P＜0.05）和α-SMA水平显著增加（P＜0.05）。CMECs细胞中METTL14敲低加剧了这些变化（P＜0.05），当加入USP48过表达质粒则逆转了这些变化（P＜0.05）（图5）。

图5 METTL14通过USP48对OGD诱导的CMECs细胞起保护作用Fig.5 METTL14 protects CMECs cells induced by OGD through USP48

3 讨论

MI引起的微血管损伤的分子机制相对复杂，因此在心脏MI损伤期间保护心脏微循环的药物很少。m6A修饰是真核mRNA和非编码RNA中最丰富的修饰，在各种人类疾病中发挥着重要作用，包括癌症进展、糖尿病、神经发育障碍和缺血性心脏病［10］。最新证据［11-13］表明m6A修饰与CVD的发生和进展密切相关，包括心脏肥大、心力衰竭、缺血性心脏病等。然而，METTL14是否与心血管疾病有关，例如MI，在很大程度上是未知的。在这项研究中，我们证明MI中m6A水平显著增加是由于甲基转移酶METTL14的下调。METTL14上调改善MI小鼠的微血管损伤和心脏功能，与先前研究发现一致［14-15］。

几项研究已经描述了METTL14在内皮损伤中的作用，但是这些报道的结论并不一致。研究［16］表明，人动脉平滑肌细胞模型中的METTL14沉默减少了钙化并增强了血管修复功能。另一项研究［17］报道，METTL14的表达降低可以抑制内皮炎症和动脉粥样硬化的发展，表明METTL14可能作为动脉粥样硬化临床治疗的潜在靶点。然而，与m6A水平升高会导致许多心脏病的心脏损伤的证据相反，PANG等［18］研究发现，在I/R损伤期间，腺病毒介导的METTL14过表达显著减少了梗死面积和内皮细胞凋亡，并改善了心脏功能。我们的结果与PANG等［18］发现一致，功能增益和功能丧失测定结果显示，METTL14上调改善MI小鼠的微血管损伤和心脏功能，METTL14敲低则加剧了OGD诱导的CMECs细胞损伤。这些数据解释了METTL14介导的m6A修饰对缺血性心脏的保护作用。

据报道，线粒体损伤有助于MI诱导的内皮损伤［19］。心肌缺血迅速增强线粒体裂变因子诱导的线粒体裂变，导致mtDNA损伤和内皮氧化应激［19］。此外，心肌缺血通过诱导线粒体膜高渗透性、mPTP开放和细胞色素c渗漏来激活线粒体凋亡［20］。同样地，本研究发现在MI处理的CMECs中线粒体形态学发生改变，氧化应激被诱导，而AAV9-METTL14抑制了MI诱导的内皮线粒体功能障碍。从机制上讲，CMECs细胞中降低的METTL14会刺激USP48 mRNA的m6A修饰，导致USP48的稳定性降低。先前研究［21］已证实，USP48在肝细胞癌中的异常表达与METTL14诱导的m6A修饰有关，该修饰影响了USP48 mRNA的稳定性。此外，代谢是USP48消融改变的最显著富集的途径，即USP48的消耗增强了有氧糖酵解的代谢通量，同时增加了线粒体断裂［22］。在进一步研究中，我们发现USP48过表达逆转了OGD对METTL14敲低的CMECs细胞的损伤作用。这些结果表明，METTL14可能通过调节USP48的m6A修饰参与介导MI内皮线粒体功能障碍。

总之，我们的研究结果首次揭示METTL14在MI中低表达，并通过增加CMECs细胞USP48的m6A修饰水平以降低其稳定性，从而介导CMECs细胞线粒体功能障碍。我们的工作揭示了MI的新致病机制，并为探索有效的MI治疗策略开辟了新途径。然而，m6A稳态是通过m6A甲基化酶复合物和去甲基化酶的协调调节来实现，本研究并未阐明METTL3和METTL14的相互作用关系，及其对m6A修饰水平的影响，值得在未来的研究中做进一步探讨。