GTPBP2通过Wnt/β-catenin信号通路调控结直肠癌干细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭和凋亡

柯超 周红见 蒋斌 谢兴旺 张超 (武汉市第三医院胃肠腹壁与疝外科,湖北 武汉 430061)

结直肠癌是全球第3大常见癌症和第4大癌症相关死亡原因〔1〕。遗传变异和细胞环境是影响肿瘤发生、发展和转移的主要原因〔2〕。尽管结直肠癌的诊断方法和综合治疗取得了显著进展,但患者5年生存率仅为15%左右〔3,4〕。因此,研究结直肠癌发生发展的分子机制,寻找有效治疗靶点,对结直肠癌的诊断和治疗具有重要意义。由于结直肠癌的高复发率和高异质性,具有自我更新和分化能力的肿瘤干细胞成为许多研究者的研究对象〔5〕。肿瘤转移是一个复杂、多步骤的过程,结直肠癌干细胞是结直肠癌发生、进展、侵袭和耐药性的关键细胞亚群〔6〕。研究报道,GTP结合蛋白(GTPBP)2是G蛋白超家族的成员,位于人6p21.13,具有G蛋白激酶活性〔7〕。沉默GTPBP2可抑制非小细胞肺癌细胞迁移、侵袭和增殖能力〔8〕。然而,GTPBP2在结直肠癌中的表达和作用未见报道。Wnt/β-catenin信号通路失调在结直肠癌的发病机制中起重要作用,灯盏花素可通过减弱Wnt/β-catenin信号级联来改善结肠炎相关的结直肠癌〔9〕。尽管已有多项研究报道Wnt/β-catenin信号通路在结直肠癌中的作用,但GTPBP2对结直肠癌进展的作用及其分子机制是否与Wnt/β-catenin信号通路有关还尚未清楚,本实验研究GTPBP2对结直肠癌干细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭、凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1临床资料 选取武汉市第三医院2017年1月至2019年1月30例结直肠癌患者的结直肠癌组织及其癌旁组织,手术切除后立即将样本-80 ℃保存,患者均知情且同意,本研究经医院伦理委员会批准。

1.2细胞与试剂 人结直肠癌细胞SW480购自中国科学院上海细胞库;胎牛血清、DMEM/F12培养基购自美国Gibco公司;Trziol、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒购自日本TaKaRa公司;放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自上海研谨生物科技有限公司;CD133磁珠分选试剂盒购自中科雷鸣科技有限公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司;Transwell小室购于美国密理博公司;膜联蛋白(Annexin)Ⅴ-PE/7-AAD流式试剂盒购自美国BD公司;si-NC、si-GTPBP2购自上海吉玛制药技术有限公司;Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。

1.3CD133阳性细胞分离 采用免疫磁珠法分选出人结直肠癌SW480细胞的CD133阳性肿瘤干细胞,取对数生长期SW480细胞,以磁珠试剂盒缓冲液重悬,计数,与CD133磁珠冰上孵育30 min,加入缓冲液洗涤离心2次,将细胞沉淀用500 μl缓冲液重悬,经过磁珠分选仪获得CD133阴性细胞和CD133阳性细胞〔10〕。

1.4结直肠癌干细胞处理与分组 按照Lipofectamine2000试剂盒说明将si-NC、si-GTPBP2转染至CD133阳性细胞中,分别记为si-NC组、si-GTPBP2组,未经转染的CD133阳性细胞记为Con组。

1.5RT-qPCR 提取组织和各组CD133阳性细胞总RNA,反转录成cDNA,以GAPDH为内参检测GTPBP2 mRNA表达水平,相对表达量采用2-△△Ct法计算。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6MTT 取各组CD133阳性细胞(2.5×104个/ml),接种于96孔板(100 μl/L),72 h后,每孔加入MTT溶液20 μl,培养4 h,弃上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl,室温震荡孵育5 min,酶标仪检测450 nm处的OD值,存活率=OD实验组/OD对照组×100%。

1.7Transwell 将各组CD133阳性细胞接种于Transwell小室上室,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,在37 ℃下孵育24 h后,用棉签擦去未穿膜的细胞。甲醛固定30 min,0.1%结晶紫染液染色30 min。置于显微镜下计数。

1.8Annexin Ⅴ 将各组CD133阳性细胞培养于6孔板,在50 μl结合缓冲液中加入5 μl 7-氨基分霉素(7AA)D,混匀后,室温、避光反应10 min,加入450 μl结合缓冲液和1 μl Annexin Ⅴ-PE,混匀后,室温、避光反应10 min,流式细胞仪进行观察和检测。70%乙醇4 ℃固定2 h,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗1次,加入0.5 ml碘化丙啶(PI),37 ℃避光温浴30 min,4 ℃避光,流式细胞仪在激发488 nm波长处检测红色荧光,并检测光散射情况。

1.9Western印迹 取对数生长期的CD133阴性细胞和CD133阳性细胞,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,制成单细胞悬液,以1×106/L浓度接种于培养皿,培养24 h。提取CD133阴性细胞、CD133阳性细胞、Con组、si-NC组、si-GTPBP2组细胞总蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),转膜,一抗4 ℃孵育过夜,二抗37 ℃孵育1 h,显色曝光,以GAPDH作为内参。

1.10统计学处理 采用SPSS21.0软件进行独立样本t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1GTPBP2在结直肠癌组织中表达 结直肠癌组织GTPBP2 mRNA和蛋白表达(3.62±0.26、0.53±0.04)显著高于癌旁组织(1.00±0.06、0.21±0.03;t=9.656、7.165,均P=0.000)。见图1。

图1 结直肠癌组织及癌旁组织GTPBP2蛋白表达

2.2CD133阳性细胞干性基因表达 CD133阳性细胞干细胞表面标志物八聚体结合蛋白(Oct)-4、性别决定区Y框蛋白(SOX)-2、胚胎干细胞相关转录因子(Nanog)表达水平显著高于CD133阴性细胞(P<0.05)。见图2、表1。

表1 CD133阳性细胞干细胞表面标志物Oct-4、SOX-2、Nanog蛋白表达

2.3沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞增殖和细胞周期的影响 与si-NC组比较,si-GTPBP2组GTPBP2表达水平、细胞存活率、S期细胞比例及细胞周期蛋白(Cyclin)D1、细胞核增殖抗原(Ki)-67蛋白表达降低,G0-G1细胞比例、p21蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05);Con组以上各指标无统计学差异(P>0.05)。见图3、表2。

表2 沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞增殖和细胞周期的影响

图3 3组增殖和细胞周期相关蛋白的表达

2.4沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞迁移和侵袭的影响 与si-NC组相比,si-GTPBP2组迁移、侵袭细胞数及基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达明显降低(P<0.05),Con组以上各指标差异无统计学意义(P>0.05)。见图4、表3、图5。

表3 沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

图4 沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞迁移和侵袭(结晶紫染色,×200)的影响

图5 Western印迹检测各组迁移、侵袭、凋亡及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达

2.5沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞凋亡的影响 与si-NC组比较,si-GTPBP2组细胞凋亡率、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关蛋白(Bax)蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05),Con组以上各指标无统计学差异(P>0.05)。见表3、图5、图6。

图6 沉默GTPBP2对结直肠癌干细胞凋亡的影响

2.6沉默GTPBP2对Wnt/β-catenin信号通路的影响 与si-NC组比较,si-GTPBP2组p-GSK3β、β-catenin蛋白表达明显降低(P<0.05),Con组以上各指标差异有统计学意义(P>0.05)。见图5、表4。

表4 沉默GTPBP2对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响

3 讨 论

肿瘤干细胞是一类具有自我更新和分化成异质癌细胞系能力的独特特征的细胞。肿瘤干细胞在肿瘤复发与转移发挥重要作用。CD133和CD44是公认的干细胞生物标志物,且在结直肠癌表现出干细胞相似性〔11〕。本研究结果表明,CD133阳性细胞具有干细胞特性。

GTPBPs是一类具有信号转导功能的蛋白质,在细胞信号传递、骨架调节及蛋白质合成等中发挥重要作用,GTPBP2在非小细胞肺癌组织中高表达,其高表达与TNM分期及淋巴结转移有关,且可通过与信号通路相互作用参与肿瘤的发生发展〔12〕。GTPBP2在人和小鼠之间高度保守,存在于人体的绝大部分组织和器官。目前,人类对GTPBP2的研究仅限于遗传学〔13〕。GTPBP2可与转录调控分子SMAD1结合并参与骨形成蛋白(BMP)/SMAD1信号通路〔14〕。GTPBP2等位基因失活变异与家族性神经发育障碍和智力残疾有关,在维持细胞正常发育中发挥重要作用〔15〕。本研究结果提示,沉默GTPBP2可抑制结直肠癌干细胞的增殖、细胞周期进程、迁移、侵袭,促进细胞凋亡。

Wnt信号通路具有高度保守性,包括Wnt基因家族与Wnt受体等〔10〕。研究发现,Wnt信号通路主要包括Wnt/β-catenin、Wnt/平面细胞极性(PCP)和Wnt/Ca2+信号通路,其中Wnt/β-catenin信号通路最为关键和经典。Wnt/β-catenin信号通路在多种人类肿瘤发展中起着重要作用,miR-758通过调节Wnt/β-catenin信号通路靶向抑制HMGB3表达,从而抑制宫颈癌细胞增殖和转移〔16〕。Wnt/β-catenin通路在诱导和维持卵巢癌干细胞特性、诱导干细胞化和化疗耐药性方面至关重要〔17〕。Circ-DENND4C通过激活Wnt/β-catenin信号通路来上调TCF4表达,从而促进肝癌细胞的恶性生物学行为〔18〕。敲除Tim-1可抑制Wnt/β-catenin信号通路激活,抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力〔19〕。miR-377-3p通过调节EMT和Wnt/β-catenin信号通路显著抑制骨肉瘤细胞的生长和迁移〔20〕。本研究结果与上述研究结果相似,提示沉默GTPBP2可抑制Wnt/β-catenin信号通路活性。

综上,GTPBP2在结直肠癌中高表达,沉默GTPBP2可抑制结直肠癌干细胞增殖、迁移和侵袭,阻滞细胞周期进程,并促进凋亡,沉默GTPBP2可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路调控结直肠癌干细胞的恶性行为。