环状RNA circ_0010423 在宫颈癌中的表达及临床意义△

毛雪宝，王秀虹，邱彬，李美灵，马丹，蒋金朋

咸宁市中心医院（湖北科技学院附属第一医院）妇科，湖北咸宁 437100

当前宫颈癌已被列为全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，在女性肿瘤死亡原因中居第四位[1]。流行病学资料显示，约85%的宫颈癌发生在低收入地区和国家[2]。高危型人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染与宫颈癌的发生密切相关，约95%的肿瘤组织中已鉴定出HPV 基因组，其中HPVE7和E6基因整合到宿主基因组被认为是宫颈癌发生发展的关键步骤[3]。目前，接种HPV 疫苗是预防宫颈癌最直接有效的方法，但各国由于医疗负担的不同尚未能实现有效推广。宫颈癌早期临床症状与宫颈炎十分相似，因而容易漏诊，而当确诊时往往已处于中晚期，预后不佳[4]。因此，探究高灵敏度和特异度的无创生物标志物对宫颈癌的早期筛查、诊断、治疗和预后监测具有重要意义。

环状RNA（circular RNA，circRNA）是近年来发现的一类具有共价闭合环结构的内源性非编码RNA，经证实其在宫颈癌的发生发展中具有关键的调控作用[5]。circ_0010423 来源于亲本基因磷酸酶张力蛋白同源物诱导激酶1（phosphatase and tensin homolog induced kinase 1，PINK1），位于人染色体chr1：20966384-20971165 区域，由其第3 和4 号外显子头尾剪接拼接形成，长度为284 bp。作为一种新的circRNA，目前尚无研究报道circ_0010423与宫颈癌的关系。研究组前期通过生物信息学分析基因表达综合（Gene Expresion Omnibus，GEO）数据库中有关宫颈癌的circRNA 微阵列表达谱发现，circ_0010423 在宫颈癌中高表达。本研究验证circ_0010423 在宫颈癌中的表达水平，分析临床意义，并探讨其与宫颈癌患者预后的关系，以期为改善该病的诊疗提供相关理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015 年1 月至2017 年12 月咸宁市中心医院收治的宫颈癌患者的病历资料。纳入标准：经病理检查证实为宫颈癌；术后随访依从性好；病历资料完整。排除标准：其他部位肿瘤伴宫颈转移；因严重肝、肾、心及肺功能不全，凝血功能障碍，血糖、血压控制不良等无法耐受手术；严重精神障碍；无手术治疗意愿。根据纳入、排除标准，共纳入180 例宫颈癌患者，年龄33～74 岁，平均（56.08±12.07）岁，＜60岁77例，≥60岁103例；肿瘤大小：＜4 cm 125 例，≥4 cm 55 例；组织学类型：鳞状细胞癌148 例，腺癌32 例；分化程度：高分化140 例，低分化40 例；高危型HPV 感染：无115 例，有65 例；宫颈浸润：＜2/3 53 例，≥2/3 127 例；淋巴结转移：无68例，有112 例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ～Ⅱ期61例，Ⅲ～Ⅳ期119例；糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）：＜35 U/ml 87 例，≥35 U/ml 93 例；鳞状上皮细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen，SCC-Ag）：＜4 μg/L 46 例，≥4 μg/L 134例。取180 例宫颈癌患者的宫颈癌组织和癌旁组织。本研究经医院伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意。

1.2 检测方法

1.2.1 离心吸附柱法提取样本中总RNA 取出液氮中保存的组织块10～20 mg，加入300 μl 裂解液（含β-巯基乙醇），剪碎组织块并用研磨杵彻底研磨。加入590 μl ddH2O 和10 μl 蛋白酶K，56 ℃放置15 min，13 000 r/min 离心5 min，取上清。上清中加入0.5 倍体积的无水乙醇，混匀后置于吸附柱中，13 000 r/min 离心60 s。首先吸附柱中添加350 μl去蛋白液RW1，13 000 r/min 离心60 s。随后吸附柱中添加80 μl 的DNase Ⅰ工作液，37 ℃放置15 min，并加入350 μl 去蛋白液RW1，13 000 r/min离心60 s。然后吸附柱中加入500 μl 漂洗液RW，37 ℃静置2 min，13 000 r/min 离心60 s。最后将吸附柱转入一个新的离心管中，加入50 μl ddH2O，37 ℃静置2 min，13 000 r/min 离心2 min，即得到总RNA，并测定纯度与浓度。

1.2.2 随机引物法进行互补DNA 合成 取微型离心管，依次加入1 μl 随机引物（50 ng/μl）、1 μl dNTP mix（10 mmol/L）、2 μg 总RNA 以及适量ddH2O 至总体积为13 μl，充分混匀，65 ℃反应5 min，然后放置冰上至少1 min。随后向离心管中依次加入4 μl 5×SSIV Buffer、1 μl 100 mmol/L 二硫苏糖醇、1 μl 核糖核酸酶抑制剂以及1 μl Super-Script™Ⅳ反转录酶（200 U/μl），充分混匀，23 ℃反应10 min，53 ℃反应10 min，80 ℃反应10 min，即得到互补DNA，并放置-20 ℃保存。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（poIymerase chain reaction，PCR）法检测circ_0010423、基质金属蛋白酶（matrix metaIIoproteinase，MMP）2、MMP9mRNA 水平 取微型离心管，依次加入12.5 μl 2×TB Green Premix Ex Taq ⅡROX plus buffer、1 μl 上游引物（10 μmol/L）、1 μl 下游引物（10 μmol/L）、2 μl 互补DNA（＜100 ng）以及8.5 μl ddH2O至总体积为25 μl，充分混匀。95 ℃反应30 s，一个循环；95 ℃反应5 s，60 ℃反应45 s，40 个循环；72 ℃反应5 min，4 ℃反应20 min，一个循环。引物由生工生物工程公司合成，circ_0010423 上游：5'-GTCGACTACCCTGATGTGCT-3'，下游：5'-GTAAGTGACTGCTCCATACTCC-3'；MMP2上游：5'-TACAGGATCATTGGCTACACACC-3'，下游：5'-GGTCACATCGCTCCAGACT-3'；MMP9上游：5'-TGTACCGCTATGGTTACACTCG- 3'，下游：5'-GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3'；GAPDH上游：5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT- 3'，下游：5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。以GAPDH为内参对照，并使用2-ΔΔCt法计算样本中circ_0010423、MMP2及MMP9mRNA 表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件进行数据分析，GraphPad Prism 5.0 软件制图。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier 生存曲线和Log-rank 检验分析circ_0010423 表达与预后的关系；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析circ_0010423、CA125、SCC-Ag 检测对宫颈癌淋巴结转移与宫颈浸润的诊断价值，并计算曲线下面积（area under the curve，AUC）；相关分析采用Pearson 相关性分析；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 宫颈癌组织和癌旁组织中circ_0010423 表达水平的比较

实时荧光定量PCR 检测结果显示，宫颈癌组织中circ_0010423 表达水平为（0.611±0.154），明显高于癌旁组织的（0.394±0.107），差异有统计学意义（t=15.253，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中circ_0010423 表达水平的比较

有高危型HPV 感染、宫颈浸润≥2/3、有淋巴结转移及FIGO 分期为Ⅲ～Ⅳ期的宫颈癌患者宫颈癌组织中circ_0010423 表达水平分别明显高于无高危型HPV 感染、宫颈浸润＜2/3、无淋巴结转移及FIGO 分期为Ⅰ～Ⅱ期患者，差异均有统计学意义（P＜0.01）；不同年龄、肿瘤大小、分化程度、组织学类型及CA125、SCC-Ag 水平宫颈癌患者宫颈癌组织中circ_0010423 表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中circ_0010423表达水平的比较

2.3 circ_0010423 表达与宫颈癌患者预后的关系

以肿瘤组织中circ_0010423 表达水平的均数（0.611）为界，将宫颈癌患者分为circ_0010423 高表达患者95 例与circ_0010423 低表达患者85 例。Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，circ_0010423 高表达患者5 年生存率明显低于circ_0010423 低表达患者，差异有统计学意义（χ2=6.493，P＜0.01）。（图1）

图1 circ_0010423高表达（n=95）与circ_0010423低表达（n=85）宫颈癌患者的生存曲线

2.4 宫颈癌组织中circ_0010423 与MMP2、MMP9表达的相关性

实时荧光定量PCR 检测结果显示，宫颈癌组织中MMP2、MMP9mRNA 表达水平分别为（1.03±0.18）、（4.62±0.80），分别明显高于癌旁组织中的（0.34±0.09）、（1.55±0.23），差异均有统计学意义（t=13.290、21.584，P＜0.01）。宫颈癌组织中circ_0010423 与MMP2、MMP9的表达水平均呈正相关（r=0.703、0.855，P＜0.01）。

2.5 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 检测对淋巴结转移和宫颈浸润的诊断价值

ROC 曲线分析结果显示，circ_0010423 单独检测诊断淋巴结转移和宫颈浸润的AUC 大于CA125和SCC-Ag 单独检测，但三者联合检测时AUC 最大。（表2、表3）

表2 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 单独及联合检测对淋巴结转移的诊断价值

表3 circ_0010423、CA125、SCC-Ag 单独及联合检测对宫颈浸润的诊断价值

3 讨论

circRNA 是一类内源性、保守的单链RNA，由于没有5'帽和3'poly-A 尾结构，使得其稳定表达于各种组织和细胞外液中[6]。随着高通量测序和生物信息学的发展，越来越多的circRNA 在各种物种、组织及细胞系中被鉴定出来[7]。目前一些circRNA 已被证明可参与肿瘤相关的生物学过程，包括增殖、凋亡、侵袭及转移等[8-9]。例如，circ_P4HB 通过调节miRNA-1184/溶质载体家族7成员 11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）通路保护肺腺癌免于铁死亡并促进恶性进展[10]。circ_NFATC3 作为肿瘤抑制因子通过调节JUN 氨基末端激酶（JUN N-terminal kinase，JNK）、c-Jun、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）和雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路抑制肝细胞癌进展[11]。此外，宫颈癌中circ_0000745 下调通过降低E-钙黏蛋白表达来增强细胞增殖、迁移和侵袭的能力[12]，而circ_0087429 上调则可抑制细胞增殖、迁移和侵袭的能力[13]。因此，针对circRNA 作为肿瘤候选生物标志物和潜在治疗靶点的研究具有十分广阔的应用前景和科学意义[14]。

本研究发现，宫颈癌组织中circ_0010423 表达水平高于癌旁组织，与GSE169057 和GSE166466芯片报道结果一致。通过分析circ_0010423 表达与宫颈癌临床特征之间的关系发现，circ_0010423表达与高危型HPV 感染有关，提示circ_0010423 可能参与HPV 介导的宫颈癌致癌过程；circ_0010423表达与FIGO 分期有关，说明circ_0010423 可以影响宫颈癌进展，与已发表的调控宫颈癌进展相关的circRNA 具有相似性，如circ_ABCB10[15]、circ_0087429[13]、circ_CLK3[16]等；此外，circ_0010423 表达与淋巴结转移及宫颈浸润有关，说明circ_0010423 可以影响宫颈癌侵袭转移。MMP2 和MMP9属于基质金属蛋白酶家族成员，是一种细胞外基质蛋白水解酶，与宫颈癌侵袭转移密切相关[17]。本研究发现，宫颈癌组织中MMP2、MMP9mRNA表达水平均高于癌旁组织，该结果与既往文献报道一致[18]。并且circ_0010423 与MMP2、MMP9表达水平均呈正相关，进一步说明circ_0010423 可以调控宫颈癌侵袭转移。以上证据表明，circ_0010423 在宫颈癌进展中具有重要作用。

通过生存曲线分析circ_0010423 表达与宫颈癌患者预后的关系发现，circ_0010423 高表达患者5 年生存率低于circ_0010423 低表达患者，说明circ_0010423 表达与预后有关，可以作为宫颈癌预后监测的一个重要指标。众所周知，肿瘤预后与侵袭转移密切相关，高侵袭转移患者往往预示预后不良。因此，早期监测宫颈癌侵袭转移从而合理制订治疗方案对提高患者预后具有重大意义。本研究通过ROC 曲线比较circ_0010423、CA125、SCC-Ag 检测对淋巴结转移与宫颈浸润的诊断价值发现，circ_0010423 单独检测对淋巴结转移和宫颈浸润的诊断效能高于CA125 和SCC-Ag 单独检测，但三者联合检测时诊断效能最高，说明circ_0010423 联合CA125 和SCC-Ag 是诊断淋巴结转移与宫颈浸润的潜在标志物。

众多研究表明，miRNA参与调控宫颈癌进展，如miRNA-93-5p[19]、miRNA-18a[20]、miRNA-485-5p[21]及miRNA-132 等[22]。circRNA 可作为竞争性内源性RNA调控miRNA表达从而影响肿瘤发生发展[23]。为了进一步从分子机制层面解释circ_0010423与宫颈癌进展有关，研究组采用生物信息学工具（https://circinteractome.nia.nih.gov/mirna_target_sites.html）发现一批miRNA 可能受circ_0010423 调控，其中包括miRNA-1290、miRNA-149、miRNA-296-5p、miRNA-331-3p、miRNA-432、miRNA-503、miRNA-524-3p、miRNA-525-3p、miRNA-564、miRNA-589、miRNA-639 及miRNA-885-3p。这些miRNA 中miRNA-149[24]、miRNA-296-5p[25]、miRNA-331-3p[26]、miRNA-432[27]及miRNA-503[28]已被证实可以抑制宫颈癌进展。据此推测，circ_0010423 可能通过调控上述miRNA 参与宫颈癌进展，但仍有待细胞实验与动物模型验证。

综上所述，circ_0010423 在宫颈癌中表达上调，与高危型HPV 感染、宫颈浸润、淋巴结转移、FIGO分期及预后有关。circ_0010423 联合CA125 和SCC-Ag 有作为淋巴结转移与宫颈浸润诊断标志物的潜力。