中药遗传毒性研究现状及探讨

黄财顺,赖昌威,萧绮珊,郑文燕,陆璐璐,王乾蕾*

中药的历史悠久,广泛应用于各种疾病。但由于中药的作用机理较复杂,其用药安全性备受关注。药物的安全性评价,除了大众熟悉的急性毒性试验和长期毒性试验,还包括病理组织学研究、生殖毒性试验、安全药理学研究、遗传毒性研究等。其中,遗传毒性研究在近十年发展迅速,已成为药物安全性评价的重要手段。

遗传毒是恶性肿瘤发展过程的重要环节,以基因突变、染色体损伤、DNA损伤等效应为基础。一般情况下,遗传毒性试验可用于致癌性预测,是药物非临床安全性评价的重要内容,与其他毒理学研究有着密切的联系,是药物进入临床试验及上市的重要环节,对于致癌性、生殖毒性等研究意义重大。拟用于人体的药物,上市前,应考虑进行遗传毒性试验,根据受试物的适应症和作用特点等因素进行相关试验的设计。通过一系列的遗传毒性试验,受试物的致畸、致癌、致突变可得到有效预测,为药品、化妆品、医疗器械及保健食品上市前做安全性评价。由于大部分遗传毒性试验的检测终点不同,所以在进行中药安全性评价时,要根据中药药效物质的适用证和作用特点等综合评估后进行遗传毒性研究,更客观地分析评价。常用的非临床遗传毒性试验组合包括沙门氏菌回复突变试验(Ames)、小鼠染色体畸变(CA)、小鼠微核试验(MN)及彗星试验等[1-8]。

中药及其相关制剂的遗传毒性研究早有报道,但至今未进行系统的综述。本文对近十年来关于中药遗传毒性的研究进行综述,总结相关研究进展。

1 研究进展

目前,Ames试验、微核试验及精子畸形试验是中药遗传毒性研究的三种主要方法。这三项遗传试验是国际协调组织(international conference on harmonization,ICH)推荐的试验组合之一,于2011年正式推广使用,此后便成为药物遗传毒性试验的“黄金组合”。Ames试验是化学物质基因突变的常用检测方法,全称为污染物致突变性检测;微核试验可检测染色体的损伤状况,是一种常用的遗传毒性试验方法;染色体畸变试验是一项致突变性试验,是检测化学物质影响染色体数量和结构的基本方法,用于评价受试物致突变的可能性。

根据药物的用途,笔者等将文献报道过的中药分为补益、清热解毒、活血通络及其他四大类。

1.1 补益类中药的遗传毒性研究 此类药物的主要作用为补虚扶弱,补益人体物质亏损,具有益气、养血、滋阴、助阳的作用,多用于增强体质和免疫力,是应用最为广泛的中药,也是遗传毒性研究的重点。杨秀静等[9]通过Ames试验、细胞微核试验及畸变试验对安神胶囊的遗传毒性进行研究,结果并未发现有遗传毒性;吉雅琪等[10]采用鼠伤寒沙门氏菌TA1535、TA102、TA100、TA98、TA97a进行细菌回复突变(Ames)试验,采用ICR小鼠进行骨髓细胞微核试验,采用仓鼠肺成纤维(CHL)细胞进行染色体畸变试验,综合评估补血益母丸干膏粉的遗传毒性。刺五加白茯片、冬虫夏草西洋参复合物等药物也有相关报道,但均未发现有遗传毒性[11-24]。

1.2 清热解毒类中药的遗传毒性研究 清热解毒药是指以解热毒、火毒、疫毒等为主要作用的一类药物,多用于温毒、瘟疫及热毒病证或疮疡疔毒的治疗。曲见松等[25]通过Ames试验、细胞微核试验及畸变试验对小儿牛黄清心散的遗传毒性进行研究,结果并未发现有遗传毒性;冯丁山等[26]和滕云霞等[27]以同样的试验方法,未发现木棉花和宫炎平片有遗传毒性;但研究牛黄解毒片对CHL细胞的DNA损伤作用时,发现其高浓度水溶液会引起体外培养的CHL细胞DNA损伤[28];胡燕平等[29]在基因突变试验(MLA)中发现两色金鸡菊具有致突变性;宋俊斋等[30]应用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验和精子畸形实验研究中药细辛的遗传毒性,发现细辛的水煎液具有致突变作用。

1.3 活血通络类中药的遗传毒性研究 活血通络药多为苦温辛散之品,临床上主要用于气滞血瘀、经脉瘀阻等引起的一些病症,比如脑血栓、脑梗塞、头痛、胸痛及风湿痹痛等。侯艳等[31]选用ICR小鼠,通过一次性给予丹参注射液方法观察其毒性反应,结合Ames试验和染色体畸变实验,对丹参注射液做了遗传毒性研究;马会等[32]通过细菌回复突变试验(Ames试验)、小鼠睾丸染色体畸变试验和小鼠骨髓细胞微核试验的组合方式评价三七红曲复方制剂的遗传毒性,结果未见遗传毒性作用;浮海石、注射用三七素、银杏内酯B注射液等药物均未发现有遗传毒性[33-37]。田逸君[38]发现,雷公藤内酯醇在720 g/kg剂量下可增加骨髓嗜多染红细胞微核率,具有潜在的遗传毒性。

1.4 其他类中药的遗传毒性研究 除了上述三大类,其他进行了遗传毒性研究的药物还包括祛斑药-当归双参蛤蟆油片[39]、止咳化痰药-枇杷叶[40]、清热除湿药-三叶白术汤口服液[41]、开窍药-通关散[42]及健胃消食药-小儿消食片[43]。生附子毒性较强,经炮制后,毒性大大降低,故盐附子遗传毒性试验呈阴性[44]。此外,研究[45]发现,马兜铃具有细胞毒性和较强的致突变性,以诱导大范围损伤为主;大黄素可导致肾脏细胞DNA损伤[46],在S9代谢活化条件下可引起TA1537菌株的突变[47]。二者均具有潜在的遗传毒性。

2 分析与讨论

笔者等在中国知网、万方及维普数据库分别以“中药”“遗传毒性”“基因毒性”等关键词进行检索,筛选并研读近15年的相关文献,重点将药物品种和结果统计分析汇总于表1。

表1 中药遗传毒性研究概况统计表

从表1可总结以下几点信息:(1)中药遗传毒性研究结果大部分为阴性,约占总数的90%;(2)研究方法主要以FDA推荐的三项遗传试验组合为主;(3)出现潜在遗传毒性的药物多是药物组方中具有药性剧烈的药物,如马兜铃、大黄、牛黄等;(4)遗传毒性评价对象多以成药制剂为主。中药制剂成分较多,因配伍不当而产生有毒物质的事情时有发生,所以有必要进行配伍药的遗传毒性测试。

上述文献研究中,不同试验的方法学特点如下:(1)Ames试验:大部分中药制剂采用了50、150、500、1 500、5 000 μg/皿的剂量,但某些中药提取物会降低受试物浓度,如雷公藤内酯醇[38]受试物设每皿1.6、8、40、200及1 000 ug共5个浓度。银杏内酯B注射液[35]则采用2 810、562、112.4、22.5及4.5 ug/皿的剂量;(2)小鼠骨髓细胞微核试验:一般采用3d内24 h间隔给药的方法,但可视具体情况调整。如有研究[46]将大黄素连续4 d给予KM小鼠1 000 mg/kg后出现6只动物死亡,故将剂量调整为600 mg/kg,给药时间调整为28 d。至于给药剂量,一般会以1/2半数致死量(LD50)为最高剂量,设低、中、高三个剂量组;(3)畸变试验:一般分为体内小鼠精子畸变试验和体外哺乳细胞染色体畸变试验。体内试验一般采用环磷酰胺(40 mg/kg)作为阳性对照组,体外试验一般采用0.5 ～ 5 mg/mL浓度的受试物及不含血清的培养液。综上所述,文献研究中,大部分学者会根据实际情况设置受试物浓度、给药时间、给药剂量等,尽量降低“假阳性”的概率。

3 发展趋势及研究策略

遗传终点具有多样化特性,导致单个实验系统不可能涵盖多个遗传终点的检测,因此探查这些终点需进行一系列实验。Ames试验、微核试验及畸变试验作为最常用的检测组合,已广泛应用于药物的遗传毒性评价上。但上述遗传毒性试验组合的准确性越来越受到质疑,原因在于该试验组合常出现“假阳性”结果。药物在体内的作用机制复杂,在体内预期的阳性暴露量下,未必能观察到该阳性结果。因此,当中药的遗传毒性试验结果为阳性时,首先应考虑结果的特异性,是否存在“假阳性”可能。中药的作用机制复杂,涉及性味归经、组方配伍、整体效应等因素,应结合体内和体外的遗传毒性试验,谨慎下结论。

除了“假阳性”,目前,中药的遗传毒性研究虽进行大量的药理毒理试验,但对导致遗传毒性产生的物质缺乏研究。此类物质包括药物本身及其杂质,其中杂质的影响最为严重。杂质一般在生产过程中产生,可从原料工艺路线的选择、质控、工艺条件的优化等方面避免。杂质是引起药品不良反应的重要因素,基因毒性杂质(genotoxic impurity,GTI)是导致基因癌症的一类物质,能引起DNA突变和重组,也称遗传毒性杂质。

目前,关于中药基因毒性杂质检测的研究并不多,但对于人体而言,基因毒性杂质的可接受限度较小,痕量水平即可产生较大危害,可将杂质研究与毒性试验相结合。图1为本文提出的研究策略。

图1 中药遗传毒性研究策略图

国家药监局在2023年发布了促进中药传承创新发展的若干意见和措施,其中明确规定要进一步加强中药不良反应监测,研究开发符合中药特点的不良反应信号监测工具,对发现的安全性风险及时防控。若能明确引起中药遗传毒性的物质或杂质,便可借助仪器设备进行快速筛查,免去传统的遗传毒性试验组合所花费的时间,达到及时防控的目的。然而,中药有别于化学药物,其成分复杂,各组分相互作用,药效物质基础尚且难以明确,更何况是痕量水平的基因毒性杂质。尽管化学药物已形成一套完整的基于LC/MS和GC/MS的基因毒性杂质检测方法，可快速识别指针性杂质，如亚硝胺类物质，但中药在这方面还是“空白”一片。