胶质硅法和鞣花酸法APTT检测临床应用效果比较

刘 伟 郭战萍 郝迎军 宋媛媛

（新乡市中心医院检验科，河南 新乡 453000）

活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）检测常用于评价内源性凝血途径异常，也可用于分析凝血因子Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ或纤维蛋白原功能缺陷[1]。口服抗凝剂或非特异性抑制剂，如狼疮样抗凝物（lupus anticoagulant，LA），可导致APTT延长。APTT还可用于评价临床肝素抗凝效果，是一个重要的筛查指标，对血栓性疾病、出血和凝血性疾病的诊断和治疗有重要的临床意义。

目前，临床实验室主要通过在血浆中加入鞣花酸、胶质硅等激活剂和磷脂（部分凝血活酶）、钙离子来测定APTT。本研究旨在探讨不同激活剂对APTT测定结果的影响，并比较基于不同激活剂的试剂检测凝血因子、LA的敏感性，建立临床普通肝素抗凝治疗范围，为临床诊疗提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本收集

采用含10%枸橼酸钠（109mmol/L）抗凝剂的真空采血管（容量3 mL）采集新乡市中心医院住院、门诊患者和健康体检者无溶血、无凝固、无黄疸、无脂静脉血标本156例，其中100例为2周内未行肝素、华法林、阿司匹林等抗凝药物治疗患者的常规送检LA的样本，56例为行普通肝素抗凝治疗患者样本，采集后轻轻颠倒混匀，1 006×g离心15 min，分离血浆，进行相关检测。

1.2 仪器和试剂

CS 5100自动凝血分析仪和APTT检测试剂盒（Hemosil SynthAsil试剂，简称HS试剂，激活剂为胶质硅；Dade Actin Activated Cephaloplastin Reagent试剂，简称DAACR试剂，激活剂为鞣花酸）均购自日本希森美康医用电子（上海）有限公司。肝素钠注射液（1.25万U/2 mL，国药准字H32023409）购自江苏万邦生化医药股份有限公司。冻干乏Ⅻ、乏Ⅺ、乏Ⅸ、乏Ⅷ因子血浆和冻干标准血浆购自德国西门子公司。

1.3 方法

分别以胶质硅和鞣花酸为激活剂，采用CS 5100全自动凝血分析仪测定100例临床标本和42份含有不同浓度肝素钠（每份血浆含肝素钠终浓度分别为0.625、0.417、0.313、0.250、0.178、0.104、0.000 U/mL）血浆标本的APTT。检测前先使用质控血浆进行测定，质控在控后再检测临床标本。

1.4 LA检测敏感性评价

收集新乡市中心医院门诊或住院患者常规送检LA的标本100例。采用2种试剂检测APTT，比较2种试剂检测LA的敏感性。患者纳入标准：2周内未行肝素、华法林、阿司匹林等抗凝药物治疗。以凝血酶原国际标准化比值（international normalized ratio，INR）＞1.20为LA阳性，以INR＞1.50为中至强阳性。

1.5 凝血因子检测敏感性评价

根据美国临床实验室标准化学会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H47-A2文件[2]要求评价APTT因子敏感性：按比例将冻干标准血浆与单因子缺乏血浆（冻干乏Ⅻ、乏Ⅺ、乏Ⅸ、乏Ⅷ因子血浆）配制成不同单凝血因子活性的混合血浆，使凝血因子活性为1%～100%。所有标本均在采集后4 h内完成测定。凝血因子检测敏感性基于非线性回归曲线与参考区间上限交叉点百分活度（%）评价。

1.6 普通肝素抗凝治疗范围的建立和动态监测趋势比

分别用2种试剂检测54例行普通肝素抗凝治疗患者血浆APTT，同时检测血浆肝素浓度（抗Ⅹa活性），将APTT和血浆肝素浓度（抗Ⅹa活性）检测结果进行线性回归分析，确定抗Ⅹa活性为0.3～0.7 IU/mL时相应的APTT。随机选取2例行普通肝素抗凝治疗的患者，收集其连续监测数据，评价2种试剂APTT检测结果的变化趋势是否一致。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量数据以±s表示，2个组之间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2种试剂检测结果比较

以鞣花酸为激活剂的DAACR试剂APTT检测结果为（29.5±4.8）s，以胶质硅为激活剂的HS试剂APTT检测结果为（38.2±8.1）s，2种试剂检测结果差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 含不同浓度肝素钠血浆标本2种试剂APTT检测结果

随着肝素钠浓度的增加，以鞣花酸为激活剂的DAACR试剂和以胶质硅为激活剂的HS试剂APTT检测结果均明显延长；DAACR试剂组变化更明显。见表1。

表1 含不同浓度肝素钠血浆标本2种试剂APTT检测结果 s

2.3 2种试剂检测LA的敏感性比较

100例常规送检LA的标本INR为0.72～2.52，其中LA阳性54例，LA中至强阳性32例；以胶质硅为激活剂的HS试剂APTT检测结果为22.5～62.8 s，以鞣花酸为激活剂的DAACR试剂APTT检测结果为19.8～61.1 s。54例LA阳性标本中，HS试剂和DAACR试剂阳性检出率分别为42.9%和55.1%，差异有统计学意义（P＜0.01）；32例LA中至强阳性标本中，HS试剂和DAACR试剂阳性检出率分别为54.3%和69.8%，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 2种试剂凝血因子检测敏感性

HS试剂参考区间上限为37.2 s，DAACR试剂参考区间上限为32.1 s。HS试剂检测凝血因子Ⅷ的敏感性＞50%（超敏感），检测凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ的敏感性为30%～50%（中度敏感）。DAACR试剂检测凝血因子Ⅺ的敏感性＞50%（超敏感），检测凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅻ的敏感性为30%～50%（中度敏感）。见表2。

表2 2种试剂检测凝血因子的敏感性 %

2.5 临床普通肝素抗凝治疗范围

抗Ⅹa活性为0.3～0.7 IU/mL时，HS试剂检测APTT对应的普通肝素治疗范围为56.9～104.7 s，DAACR试剂对应的普通肝素治疗范围为45.3～78.2 s（图1）。抗Ⅹa活性＞0.8 IU/mL时，DAACR试剂和HS试剂检测APTT结果差异较大。2种试剂连续监测2例样本的趋势一致（表3、表4、图2）。

图1 2种试剂普通肝素抗凝治疗范围

图2 普通肝素治疗患者连续监测样本APTT检测结果变化趋势

表3 病例1（普通肝素治疗）2种试剂连续监测APTT结果 s

表4 病例2（普通肝素治疗）2种试剂连续监测APTT结果 s

3 讨论

凝块激活部分的凝血活酶时间测试最早出现于1954年，当时为复钙时间测定法，随后发展为部分凝血活酶时间（partial thromboplastin time，PTT），并添加了一种由磷脂组成的兔脑组织提取物（脑磷脂），作为血小板替代物，因为不包括组织因子，被认为是“部分凝血活酶”。当添加带负电荷颗粒的接触活化剂（高岭土、二氧化硅、鞣花酸或硅藻土）以提高反应性和重现性时，被称为“活化”[3]。目前，大多APTT试剂使用的是大豆基合成磷脂和非沉降活化剂（胶体二氧化硅）。当一种APTT试剂被加入乏血小板血浆中时，可通过激活凝血因子Ⅻ在体外触发血栓形成[4]。APTT可对内在和/或共同途径中的缺陷作出反应，并随共同途径中显著单因素缺陷或多个缺陷延长。CLSI H47-A2文件[2]指出：对于APTT试剂及其检测系统，当内源性凝血因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性降低到约30%（0.3 IU）或更低时，APTT应表现为延长；纤维蛋白原水平降至2.94 μmol/L（100 mg/dL）以下时，APTT才会延长。本研究中，2种试剂对凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ的敏感性均＞30%，符合CLSI的要求。激活剂是影响APTT试剂检测凝血因子敏感性的重要因素[5-6]。本研究中，以鞣花酸为激活剂的DAACR试剂检测内源性凝血因子的敏感性高于以胶质硅为激活剂的HS试剂，也证实了这一点。

LA是一种能作用于磷脂或磷脂蛋白质复合物的IgG或IgM型免疫球蛋白，属于“抗磷脂抗体”家族[7]。LA与抗磷脂综合征、静脉和动脉血栓形成，以及产科并发症相关的血栓密切相关[8]，是病理性循环抗凝物质，对依赖磷脂的各种途径的凝血和抗凝因子具有干扰作用，可影响凝血反应，延长凝血时间。实验室基于LA在体外实验中表现出的抗磷脂作用导致的凝血时间延长来判断机体是否存在LA[9-10]。不同试剂对LA的敏感性与磷脂的含量、来源、浓度和组成，特别是磷脂酰丝氨酸含量密切相关。另外，激活剂类型也很重要。有研究发现，HS试剂含有硅成分的活化剂，更适用于LA检测[11]。

APTT还被用于监测普通肝素的抗凝作用，目前，监测普通肝素抗凝作用最常用的2种方法是APTT和抗凝血因子Ⅹa（抗Ⅹa）肝素测定。APTT检测比抗Ⅹa检测更易自动化，成本更低[9]。APTT主要是对凝血级联固有和共同途径功能的检测，普通肝素抗凝目标治疗范围以鱼精蛋白滴定法测定相应肝素浓度0.2～0.4 U/mL为基础，或以抗凝剂Ⅹa测定法测定相应肝素浓度0.3～0.7 U/mL为基础[12]，但受不同试剂差异和一些不能反映肝素活性生物因素影响[13-14]，每批新的APTT试剂都必须进行性能验证或更新目标范围；不同试剂对Ⅹa和Ⅱa因子的抑制反应不同，指导肝素治疗，应建立一个试剂特异性APTT治疗范围，相当于肝素浓度（抗Ⅹa活性）0.3～0.7 U/mL。

本研究中，当抗Ⅹa活性为0.3～0.7 IU/mL时，HS试剂APTT检测对应的普通肝素治疗范围为56.9～104.7 s，DAACR试剂APTT检测对应的普通肝素治疗范围为45.3～78.2 s。抗Ⅹa活性＞0.8 IU/mL时，DAACR试剂和HS试剂APTT的检测结果差异较大；2种试剂对2例患者连续监测标本的检测结果显示，APTT的变化趋势一致。

综上所述，分别以胶质硅和鞣花酸为激活剂的2种试剂均能满足临床对凝血因子、LA敏感性的需求，但对肝素、LA、凝血因子敏感性差异较大。本研究分别确定了DAACR试剂、HS试剂检测APTT对应的普通肝素治疗范围。试剂对APTT测定的影响应引起临床重视，实验室应针对相应试剂与仪器建立自己的参考区间，从而更好地指导临床合理用药。