黑果小檗果花色苷提取物对小鼠肝纤维化的改善作用及其机制

孙吉祥，李倩，刘菁，姚俊英，范旻

新疆维吾尔自治区人民医院临床营养研究所，乌鲁木齐 830001

肝纤维化是各类有害因子对肝脏造成损害后表现出的一种病理状态。肝纤维化具有向肝硬化转变的病理基础，进一步发展将导致肝脏功能衰竭，最终危及生命［1］。目前研究已经明确，导致肝纤维化的重要原因是肝脏内细胞外基质（ECM）合成与降解紊乱，而肝脏内固有的肝星状细胞（HSC）是最重要的ECM 来源［2］。肝纤维化是一种动态的双向进程，具有恢复和重塑的内在能力，对肝纤维化进行早期积极干预，是有望实现逆转其疾病进程的。近几年对肝纤维化的研究主要集中在促进HSC 凋亡以及抑制HSC 激活等方面［3-4］。花色苷是一类多羟基的类黄酮化合物，具有黄酮类化合物C6-C3-C6的特征骨架结构，由两个芳香环和一个含氧杂环组成［5］。近年来，花色苷的抗氧化能力、抑制炎症反应和抑制相关酶与蛋白表达的作用得到了肯定［6］。水飞蓟宾是临床常用的保肝药物，被证实具有稳定肝细胞膜、维持肝细胞完整性作用，可以使毒素无法穿透破坏肝脏，并能加速合成肝脏细胞的去氧核糖核酸（DNA），可预防肝硬化、脂肪肝、胆管炎等疾病［7］。2021年9月—2022 年9 月，本研究采取腹腔注射CCl4的方法建立肝纤维化小鼠模型，以水飞蓟宾为阳性对照药物，观察黑果小檗果花色苷提取物（BHSTA）对小鼠的肝脏保护作用，并探讨其可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：雄性昆明种小鼠40 只，4～6周龄，体质量18～20 g，购自新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心实验动物研究中心，动物许可证号SCXK（新）2016-0003；实验小鼠饲养于石河子大学药学院动物房，在自然昼夜节律光照下，自由进食进水，环境温度18～26 ℃，相对湿度65%～80%，适应性饲养5 d。主要试剂：CCl4购自南京化学试剂股份有限公司，阳性对照药物水飞蓟宾购自天津天士力圣特制药公司，氧化应激相关指标丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）及其下游靶基因凋亡相关微粒蛋白（ASC）、半胱天冬酶1（Caspase-1）、白细胞介素1β（IL-1β）相关抗体均购自美国ABCam公司。

1.2 BHSTA 的提取、纯化及溶液配置 成熟的黑果小檗果实购自新疆乌鲁木齐市水西沟镇南山山区，用药材粉碎机将果皮粉碎、过20 目筛，-20 ℃冰箱内避光保存备用。对鲜果的营养成分进行测定，再分别测定70%甲醇、乙醇、丙酮溶剂提取物的总酚、总花色苷含量，并检测其DPPH 自由基、羟自由基、ABTS 自由基、超氧阴离子自由基等抗氧化活性相关指标。通过响应面法优化BHSTA 的超声辅助提取工艺，确定相应的优化工艺参数。采用XDA-7A 大孔树脂对BHSTA 粗提物进行纯化，进一步得到BHSTA 纯化物冻干粉。分别称取BHSTA 1.0、4.0 g，加入到100 mL水中，搅拌均匀，得到质量浓度分别为10、40 mg/mL的BHSTA溶液。

1.3 动物分组与BHSTA处理 40只雄性昆明种小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组、模型对照组、BHSTA 低剂量组、BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组，每组8只。除正常对照组外，其余各组小鼠腹腔注射CCl4油剂（CCl4∶ 橄榄油=1∶ 4）3 µL/g，2 次/周，连续4周，建立肝纤维化模型；正常对照组腹腔注射等体积橄榄油。BHSTA 低剂量组、BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组腹腔注射CCl4油剂开始建模后，分别灌胃给予10、40 mg/kg 的BHSTA 溶液和1 µg/10 g的水飞蓟宾，1次/天，连续4周；正常对照组、模型对照组均灌胃给予等体积蒸馏水。

1.4 体质量观察 记录各组小鼠分组处理0 ～ 4周的体质量。

1.5 肝脏指数分析及肝脏组织病理观察 各组末次给药后禁食12 h，称取体质量后摘眼球取血，处死并进行解剖；剥离完整肝脏，生理盐水清洗，滤纸蘸干表面水分，肉眼观察肝脏大体形态。称取并记录肝脏质量，计算肝脏指数。肝脏指数=肝脏质量/末次体质量×100%。取各组小鼠新鲜肝脏左叶组织，10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片。HE染色后观察肝脏组织病理情况，包括肝细胞变性、坏死、细胞排列、小叶结构、有无假小叶、纤维组织增生等；Masson染色后观察肝脏组织炎症细胞浸润和胶原纤维增生情况。剩余肝脏组织保存于液氮中。

1.6 肝脏功能检测 取各组小鼠眼球血，离心后分离血清，使用全自动生化分析仪检测肝脏功能相关指标，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）。

1.7 肝脏组织SOD、GSH、MDA 表达检测 取各组小鼠部分新鲜肝脏组织，进行组织匀浆，采用改良盐酸羟胺法检测SOD、GSH、MDA表达。

1.8 肝脏组织NLRP3 及其下游靶基因蛋白检测采用Western blotting 法。取各组保存于液氮中的肝脏组织，冰上剪取质量为100 mg 的肝脏组织，采用预冷的生理盐水冲洗干净，滤纸擦干后放入干净的烧杯内。用干净消毒的手术剪刀反复剪切，称取质量后加入9 倍的裂解液RIPA 进行裂解，同时加入蛋白酶抑制剂。进行蛋白抽提前再加入0.1%苯甲基磺酰氟，进行组织匀浆，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min。取上清液，加入NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 及内参GAPDH 一抗及二抗。使用Chemi-Scopemini 化学发光仪检测、拍照，凝胶扫描成像系统进行扫描，Image J 软件分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料采用S-W 正态性检验，呈正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐的两组间比较采用LSD-t检验，方差不齐的两组间比较采用Dunnett-t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠体质量比较 模型对照组、BHSTA高剂量组各死亡1 只。随着干预时间的延长，各组小鼠体质量均呈升高趋势。分组处理第4 周，正常对照组、水飞蓟宾组、BHSTA 高剂量组、BHSTA 低剂量组、模型对照组小鼠体质量依次降低，组间两两比较P均＜0.05。见表1。

表1 各组不同时间点体质量比较（）

表1 各组不同时间点体质量比较（）

注：与正常对照组同时间点比较，*P＜0.05；与水飞蓟宾组同时间点比较，#P＜0.05；与BHSTA 高剂量组同时间点比较，△P＜0.05；与BHSTA低剂量组同时间点比较，▲P＜0.05。

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2.2 各组小鼠肝脏指数比较 正常对照组、水飞蓟宾组、BHSTA 高剂量组、BHSTA 低剂量组、模型对照组小鼠肝脏指数分别为4.84% ± 0.67%、5.29% ±1.01%、5.56% ± 0.91%、5.90% ± 0.95%、6.40% ±0.95%；与正常对照组比较，其余各组肝脏指数均升高，以模型对照组升高最明显（P均＜0.05）， 水飞蓟宾组、BHSTA 高剂量组、BHSTA 低剂量组、模型对照组小鼠肝脏指数比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.3 各组小鼠肝脏大体形态比较 正常对照组小鼠肝脏呈粉红色，表面光滑，色泽光鲜，质地柔软，容易夹碎。模型对照组小鼠肝脏暗红，肝脏表面呈细颗粒状，边缘变钝。水飞蓟宾组小鼠肝脏被膜、质地、颜色接近对照组，与模型对照组差异较为明显。BHSTA 低剂量组小鼠肝脏颜色和质地较模型对照组有所改善，部分仍有淤血现象。BHSTA 高剂量组小鼠肝脏质地进一步改善，基本没有淤血现象，与模型对照组差异较为明显。见OSID码图1。

2.4 各组肝脏组织病理观察结果比较

2.4.1 HE染色结果 正常对照组肝小叶结构比较完整，肝细胞正常，基本无变性坏死，无脂肪浸润，汇管区未发现炎症细胞浸润。模型对照组大多数肝窦消失，肝细胞可见中度或者重度水肿改变，多发气球样及脂肪样变性，并伴有炎症细胞浸润。BHSTA 低剂量组、BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组肝细胞气球样变及炎症细胞浸润较模型对照组有所减轻。见OSID码图2。

2.4.2 Masson染色结果 正常对照组汇管区未发现炎症细胞浸润和胶原纤维增生情况，仅在中央静脉等血管周围发现少量胶原纤维。模型对照组可见大量的胶原纤维增生，主要分布在汇管区和血管周围，沿汇管区或炎症坏死区可见胶原纤维向外延伸。BHSTA低剂量组、BHSTA高剂量组、水飞蓟宾组胶原纤维增生减轻，主要分布在血管区。见OSID 码图3。

2.5 各组小鼠血清AST、ALT 水平及肝脏组织SOD、GSH、MDA 表达比较 与正常对照组比较，模型对照组血清AST、ALT 水平及肝脏组织MDA 表达均升高，肝脏组织SOD、GSH 表达均降低（P均＜0.05）。与模型对照组比较，BHSTA低剂量组、BHSTA高剂量组、水飞蓟宾组血清AST、ALT 水平及肝脏组织MDA 表达均降低，肝脏组织SOD、GSH 表达均升高；其中，BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组血清AST、ALT 及肝脏组织MDA 表达降低更明显，水飞蓟宾组肝脏组织SOD、GSH 表达升高更明显（P均＜0.05）。见表2及OSID码图4。

表2 各组小鼠血清AST、ALT水平及肝脏组织SOD、GSH、MDA表达比较（）

表2 各组小鼠血清AST、ALT水平及肝脏组织SOD、GSH、MDA表达比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与水飞蓟宾组比较，#P＜0.05；与BHSTA高剂量组比较，△P＜0.05；与BHSTA低剂量组比较，▲P＜0.05。

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2.6 各组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-1β 蛋白相对表达量比较 与正常对照组比较，BHSTA 低剂量组、BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组及模型对照组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC、Caspase-1及IL-1β蛋白相对表达量均升高，以模型对照组升高最明显（P均＜0.05）。见表3。

表3 各组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量比较（）

表3 各组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白相对表达量比较（）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与水飞蓟宾组比较，#P＜0.05；与BHSTA高剂量组比较，△P＜0.05；与BHSTA低剂量组比较，▲P＜0.05。

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3 讨论

花色苷在保护肝脏方面显示出较好的生物学活性，目前其在抗肝纤维化、抗化学性肝损伤、抗酒精性肝损伤、抗肝癌、防治非酒精性脂肪肝等研究中的作用已较为明确［8-13］。研究显示，花色苷的肝脏保护作用与其抗氧化能力、抑制炎症反应与氧化应激反应等有关［14］。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型对照组小鼠体质量降低，肝脏指数及血清AST、ALT升高；病理结果显示大多数肝窦消失，肝细胞可见中度或者重度水肿改变，多发气球样及脂肪样变性，并伴有炎症细胞浸润，同时有大量胶原纤维增生；提示成功采用腹腔注射CCl4的方法建立小鼠肝纤维化模型。

水飞蓟宾的主要成分是从水飞蓟种子中提取的一种化合物，可通过稳定肝细胞膜、清除氧自由基发挥保肝作用，主要用于治疗急慢性肝炎、脂肪肝等导致的肝脏功能异常，是一种辅助治疗肝病的药物。因此，本研究选用水飞蓟宾作为阳性对照药物。本研究结果显示，与模型对照组比较，BHSTA 低剂量组、BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组体质量均升高而血清AST、ALT 水平均降低，肝细胞气球样变、炎症细胞浸润及胶原纤维增生均有所减轻，且BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组血清AST、ALT 降低更明显。这提示BHSTA 可以有效阻断小鼠肝脏组织纤维化进展，缓解炎症反应对肝细胞的损伤，达到减轻CCl4引起肝损伤的目的，具有一定的肝脏保护作用，且高剂量应用效果更明显，这与以往关于花色苷抗肝纤维化的研究结果一致［15-16］。

CCl4腹腔注射后经门静脉入肝，转化为三氯甲基自由基（CCl3·）等大量自由基，可以活化HSC，释放大量炎症细胞因子及ROS。ROS是一类氧衍生的分子，包括超氧化物、羟自由基、烷氧基、过氧化氢、臭氧等，其产生是机体或细胞内氧自由基产生与清除失衡所导致的。ROS不仅可以通过刺激免疫细胞释放促纤维化因子，还可直接刺激HSC 的增殖与活化［17］。研究发现，肝纤维化患者体内均存在大量自由基，机体抗氧化酶系统紊乱，表现为SOD、NOQ1、GSH 等表达异常。本研究选择了GSH、SOD、MDA这三个抗氧化指标，评价BHSTA 对CCl4致小鼠肝损伤的影响；结果显示，与模型对照组比较，BHSTA 低剂量组、BHSTA 高剂量组、水飞蓟宾组肝脏组织MDA表达均降低，SOD、GSH表达均升高，其中BHSTA高剂量组、水飞蓟宾组肝脏组织MDA 表达降低更明显，水飞蓟宾组肝脏组织SOD、GSH 表达升高更明显；这提示BHSTA 有助于减轻肝脏的氧化应激反应，提高其抗氧化作用及氧自由基的清除能力，从而使肝脏细胞免受自由基攻击，发挥肝脏保护作用。王治博等［18］研究发现，花色苷对提高CCl4所致急性肝损伤大鼠血清或肝脏组织抗氧化指标有积极作用。此外，花色苷可以使糖尿病大鼠血液中过氧化氢酶、SOD、GSH 水平升高［19］。李卫霞等［20］研究显示，低剂量的花色苷提取物可以提高肝损伤小鼠肝脏组织中的SOD 和GSH 表达。但是不同来源的花色苷提取物是否均具有这种抗氧化性能，仍需进一步探讨。

NLRP3 炎症小体在肝脏多种细胞中都有表达，在库普弗细胞和窦内皮细胞中表达最多，其次是门脉周围的肌成纤维细胞和HSC，这也充分说明在炎症加重肝损伤和肝纤维化的同时，在细胞水平不仅仅有巨噬细胞NLRP3 炎症小体的活化，肝细胞及HSC 中的NLRP3 炎症小体活化也参与了这一过程。不受限制的NLRP3 炎症小体激活会导致肝细胞生存时间缩短，严重肝病患者的病理特征是中性粒细胞浸润和HSC 激活，并在肝脏中形成胶原纤维沉积。研究显示，IL-1β 或IL-18 受体Ⅰ型敲除的小鼠肝纤维化模型的肝纤维化程度得到明显改善，而IL-1β 拮抗剂基因敲除小鼠表现出肝纤维化的快速进展，同时肝脏组织IL-1β、TGF-β1表达升高［21］。崔东娟等［22］研究发现，香叶木素通过抑制NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β 表达来缓解肝纤维化。王文杰等［23］研究发现，牛磺酸可以通过抗氧化及抑制NLRP3炎症小体生成来抑制酒精性肝病（ALD）的肝脏损伤，为ALD 的预防及治疗提供一定的借鉴及依据。本研究结果显示，与正常对照组比较，其余四组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC、Caspase-1 及IL-1β 蛋白相对表达量均升高，以模型对照组升高最明显；这提示肝纤维化小鼠存在NLRP3炎症小体活化，而BHSTA可以抑制NLRP3 炎症小体活化，这可能是其减轻肝纤维化的重要机制之一。此外，ROS 作为细胞的第二信使，参与了对NLRP3 炎症小体活化过程的调节，被认为是NLRP3 炎症小体活化的关键上游效应因子［24］。研究显示，ROS能够活化HSC-T6细胞中的NLRP3炎症小体及其下游效应分子，初步证实HSC-T6细胞中NLRP3 炎症小体活化对肝纤维化进展具有促进作用［25］。因此，清除过多的ROS 也是防治肝纤维化的重要环节。

综上所述，BHSTA 对小鼠肝纤维化具有一定的改善作用，其机制可能与减轻氧化应激反应及抑制NLRP3 炎症小体相关通路有关。但是，花色苷属于离子型化合物，亲水性强、脂溶性差，其应用方式仅仅停留在泡饮使用上，生物利用度较差，且相关药物研发或者功能性食品的开发未有显著进展，这是未来研究的重点。