人凝血因子Ⅷ血管刺激性和溶血性试验研究

张丽铃，黄璠，刘明星

（1.广东丹霞生物制药有限公司，广东韶关 512029；2.广东省血浆蛋白质工程技术研究中心，广东韶关 512029）

人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ，F Ⅷ）是一种大分子量糖蛋白复合物，在血浆中含量极少，1 mL 血浆中仅含100 ～150 ng，在血液循环中参与人体内源性凝血过程，若含量不足或功能缺陷，易引起凝血障碍性疾病，即甲型血友病（占血友病发病率的80%），临床上广泛采用F Ⅷ制剂用于甲型血友病患者出血替代治疗[1-2]。F Ⅷ作为一种生物制品注射剂，在临床使用前，需要充分考虑该制品注射后血管刺激性和溶血性等安全性指标。本研究依据《药品注册管理办法》和《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》开展新西兰兔血管刺激性试验和体外溶血性试验[3-4]，以评价公司自制人凝血因子Ⅷ产品的非临床安全性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

人凝血因子Ⅷ为自制样品（200 IU/ 瓶，复溶后体积为10 mL/瓶）；灭菌注射用水（批号：1404043202），石家庄四药有限公司；氯化钠注射液（批号：D13101501-2），广东科伦药业有限公司。

SB32000 电子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TP1020 脱水机、EG1160 石蜡包埋机、RM2155切片机、DM5000B 生物荧光显微镜，德国Leica 公司；RWD200 微量注射泵，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；5840R 台式高速低温离心机，德国Eppendorf Centrifuge 公司；PYX-DHS-4050 隔水式电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械有限公司；EOS 600D 数码相机，日本佳能公司。

1.2 实验动物

普通级新西兰兔，2.0 ～2.5 kg，9 只（雌性5只，雄性4 只），血管刺激性试验使用8 只（雌雄各半），体外溶血试验使用1 只（雌性）。来源于广东省医学实验动物中心（三水基地），实验动物生产许可证号SCXK（粤）2014-0035，实验动物质量合格证号44411600000443。

1.3 血管刺激性试验

参考文献[5-6]开展血管刺激性试验。本试验用8 只动物（编号V1 ～V8），均为受试物组，采用自身左右侧对照。动物在给药前进行称重、分组，根据分组当天测定的体重，通过随机数表进行分组。人凝血因子Ⅷ临床最大使用剂量为40 IU/kg，按照所提供的供试品规格和浓度计算，新西兰兔的给药量为6 mL/kg（按体表面积折算，剂量为人临床最大等效剂量）[7]。

使用恒速微量注射泵于新西兰兔耳缘静脉注射给药，注射器与针头之间连接过滤装置。采用自身对照，给药前新西兰兔耳缘静脉给药部位去毛，于左耳耳缘静脉缓慢注射给予人凝血因子Ⅷ溶液，右耳耳缘静脉给予等体积的0.9%氯化钠注射液。每天1 次，连续8 d。

给药过程中，试验操作人员需要将给药速度控制在1 ～2 mL/min，并注意动物的保定及针头的固定，防止药液渗出。每天给药前、后及停药后观察动物的一般状态、行为、体征以及注射部位反应，末次给药后72 h、14 d 分别取4 只动物解剖，进行病理制片和组织病理学检查。

病理学检查：末次给药72 h 后取4 只（V1、V3、V5、V7）新西兰兔麻醉后颈动脉放血安乐死，肉眼观察记录血管组织的反应后，从耳根部切除双兔耳，进行常规石蜡制片，然后进行组织病理学检查。其余动物（V2、V4、V6、V8）继续观察，于末次给药后14 d再进行组织病理学检查，以了解刺激性反应的可逆程度。病理评分标准见表1。

表1 血管刺激性光镜检查评分及结果判定标准

1.4 溶血性试验

参考文献[5-6]开展溶血性试验。取兔血10 mL，放入含玻璃珠的三角烧瓶中振摇10 min，除去纤维蛋白原。取脱纤血液加10 倍量的等渗溶液（生理盐水），轻轻摇匀，1 500 r/min 离心10 min，除去上清液，每管加约沉淀10 倍量的0.9%氯化钠溶液摇匀，按上述方法洗涤3 次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的混悬液，供试验用。

如表2 所示，取洁净试管7 支，进行编号，1 ～5号管为受试物（人凝血因子Ⅷ）管，6 号为阴性对照管，7 号管为阳性对照管。按表所示依次加入2%红细胞悬液、0.9%氯化钠溶液或灭菌注射用水和药液，混匀。置37 ℃恒温箱中温育3 h，于15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h 观察，判断红细胞溶解和凝集情况。

表2 溶血试验加样表（单位：mL）

2 结果与分析

2.1 新西兰兔刺激性试验

给药期间和停药期间，动物的一般观察未见明显异常。给药期间，1 号动物左右侧和7 号动物右侧注射部位呈暗红色，质地稍硬，其余动物注射部位观察未见明显异常。结合组织病理学检查（图1 和图2）及评分结果（表3），末次给药后72 h 和14 d，人凝血因子Ⅷ对新西兰兔耳缘静脉无刺激。

图1 血管刺激性试验末次给药后72 h 显微镜下观察结果（HE×100）

图2 血管刺激性试验末次给药后14 d 显微镜下观察结果（HE×100）

表3 人凝血因子Ⅷ对新西兰兔血管刺激性反应评分结果及评价

2.2 体外溶血试验

自加药后15 min 开始至3 h 观察结束时，阳性对照管上部见澄明红色，阴性对照管、人凝血因子Ⅷ（加药浓度为20 IU/mL）各稀释管上层液体均见无色澄明。因此阳性对照溶血反应为阳性，阴性对照和人凝血因子Ⅷ的各稀释度药液溶血反应均为阴性，见图3。

图3 溶血性试验结果

3 结论与讨论

人凝血因子Ⅷ系由徤康人血浆经分离、提纯，并通过S/D 法［0.3%磷酸三丁酯和1%聚山梨酯80 于（25±1）℃作用6 h]和干热法（99 ～100 ℃作用30 min）处理后，再经冻干制成的血浆蛋白制品[8]。F Ⅷ制品制备过程中，采用S/D 法进行病毒灭活，造成成品中还有微量的聚山梨酯80 残留，已有文献报道聚山梨酯作为增溶性药用辅料引起不良反应，普遍认为其存在溶血性[9]。F Ⅷ产品在长期临床实践中被证实是安全的[10]，但因F Ⅷ需经注射给药，不同厂家制备工艺不同，产品成分存在差异，故有必要对本公司F Ⅷ自制产品开展相关非临床安全研究。

人凝血因子Ⅷ临床上主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状及这类病人的手术出血治疗。临床给药途径为静脉注射，本研究为检测其刺激性和溶血性，进行新西兰兔血管刺激性试验和体外溶血试验。结果显示，人凝血因子Ⅷ对新西兰兔静脉注射给药，每天1 次，连续8 d，末次给药后72 h 和14 d，人凝血因子Ⅷ对新西兰兔耳缘静脉无刺激。人凝血因子Ⅷ体外对兔红细胞未见溶血作用，不引起红细胞凝聚。因此，本公司自制的人凝血因子Ⅷ不具有血管刺激性和溶血性，本研究的开展为产品的临床研究及应用奠定了基础。