内质网应激通路相关蛋白IRE1、PERK、ATF6 在舌鳞癌中的表达及其功能的生物信息学分析

张勇涛，李霞，李晓齐，买丽亚木古丽·阿布都克尤木，张贵程，齐鲁

（新疆医科大学 第二临床医学院，新疆乌鲁木齐 830092）

舌鳞状细胞癌（Tongue Squamous Cell Carcinoma，TSCC）是口腔中最常见的癌症之一。近年来的研究表明，全球舌鳞状细胞癌的发病率逐年上升，尤其在年轻人中发病率逐渐提高[1-2]。TSCC 极易发生早期淋巴结转移，转移率较高，且易复发，因此导致5 年生存率较低，仅有55%[3-4]。随着医学技术的发展，学者们对TSCC 的发病机理进行了广泛的研究，但其机制至今仍不明确[5]。寻求改善TSCC 治疗效果的新型诊断和预后生物标记物，有效靶向治疗TSCC，提高患者的生存质量，成为近年来研究的热点。

肌醇需求酶1（Inositol-Requiring Enzyme 1，IRE1）是一种内质网跨膜蛋白，在其细胞质区同时存在激酶和核糖核酸内酶结构域。IRE1 在哺乳动物中有IRE1α 和IRE1β 两种构型[6]。在内质网中，IRE1通过激酶和核糖核酸内酶结构域触发未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR），引起细胞凋亡[7]。蛋白激酶R 样内质网激酶（Protein Kinase R-like Endoplasmic Reticulum Kinase，PERK）是一种跨膜蛋白，有N 端压力传感结构域和胞质激酶结构域。PERK 通过诱导CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhancer-Binding Protein Homologous Protein，CHOP）表达从而起到调控细胞凋亡的作用[8]。激活转录因子6（Activating Transcription Factor 6，ATF6）作为内质网跨膜蛋白，包括ATF6α 和ATF6β 两种构型，属于环磷腺苷效应元件结合蛋白转录因子家族[9]。激活的ATF6 被转运至高尔基体进行修饰，修饰过后的ATF6 可诱导UPR 基因表达[10]。IRE1、PERK、ATF6 可在多种肿瘤组织中发挥作用，然而，目前其在舌鳞癌组织中的功能和作用机制尚未阐明。

本研究旨在通过生物信息学方法，明确IRE1、PERK、ATF6 在舌鳞癌中的表达特点及其与预后的关系，以期揭示在舌鳞癌发生发展中的作用，为进一步探索舌鳞癌的治疗方案奠定基础。

1 材料与方法

1.1 数据采集

基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库中24 名舌鳞癌患者的23 个肿瘤组织和73 个组织学正常边缘及邻近正常组织的数据测序结果为基础数据。利用GraphPad Prism 9.0 软件分析GEO 数据库中IRE1、PERK、ATF6mRNA 的表达情况。

1.2 生存分析

利用Kaplan - Meier Plotter 数据库获取头颈部鳞癌患者的临床特征及生存资料，分别分析IRE1、PERK、ATF6 的表达与总生存期（Overall Survival，OS）和无进展生存期（Recurrence-Free Survival，RFS）之间的关系，并绘制Kaplan - Meier 曲线。

1.3 功能分析

利用GeneMANIA 数据库绘制IRE1、PERK、ATF6 相关的蛋白、遗传相互作用通路和蛋白共表达网络。利用DAVID 数据库进行基因功能富集分析，了解与IRE1、PERK、ATF6 相互作用的关键基因以及参与的细胞组分、生物过程、生物功能。

1.4 统计学处理

使用VALUE 作为IRE1、PERK、ATF6 mRNA表达量度，表达量使用中位数（四分位间距）来表示。采用Kaplan - Meier生存曲线对IRE1、PERK、ATF6高、低表达组患者进行生存比较，计算95%置信区间（CI）的风险比（HR）和Log- rankP值。统计检验均采用双侧检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 IRE1、PERK、ATF6 在舌鳞癌中的表达

IRE1、PERK、ATF6 在组织学正常边缘组织及邻近正常组织中位表达量分别为2.115 19（2.115 19～2.574 66）、9.613 41（8.124 92～11.904 7）、8.716 88（7.539 33～9.654 82），在舌鳞癌组织中分别为2.115 19（2.115 19～2.117 89）、9.390 81（8.997 47～10.881 40）、8.899 36（7.992 67～9.804 02），其中ATF6 在舌鳞癌组织中表达高于组织学正常边缘组织及邻近正常组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）；IRE1、PERK在舌鳞癌组织中表达与组织学正常边缘组织及邻近正常组织的差异无统计学意义（图1）。

图1 IRE1、PERK、ATF6 在舌鳞癌及癌旁正常组织中表达

2.2 IRE1、PERK、ATF6 的表达与舌鳞癌预后关系

IRE1 高表达组患者OS 高于低表达组，差异具有统计学意义[风险比（HR）=0.73，95%置信区间（95%CI）=0.55～0.97，P=0.028]；但IRE1 的表达与头颈部鳞癌的RFS 无明显关系（HR=0.49，95%CI=0.2～1.17，P=0.1）。PERK 高表达组患者OS 高于低表达组，差异具有统计学意义（HR=0.74，95%CI=0.56 ～ 0.98，P=0.033）；但PERK 的表达与头颈部鳞癌的RFS 无明显关系（HR=0.68，95%CI=0.32～1.43，P=0.3）。ATF6 高表达组患者OS 低于低表达组，差异具有统计学意义（HR=1.45，95%CI=1.1～1.91，P=0.008 1）；但ATF6 的表达与头颈部鳞癌的RFS 无明显关系（HR=1.99，95%CI=0.92～4.33，P=0.076）（图2）。

图2 IRE1、PERK、ATF6 表达与舌鳞癌的预后的关系

2.3 IRE1、PERK、ATF6 相互蛋白作用网络预测及功能分析

筛选出热休克蛋白5（Heat Shock Protein 5，HSPA5）、含三联基元3（Tripartite Motif-containing 3，TRIM3）、TAO 激酶3（TAO kinase 3，TAOK3）等20 个与IRE1 相互作用的蛋白质，激活转录因子4（Activating Transcription Factor 4，ATF4）、转导蛋白(β)样2（Transducin (Beta)-Like 2，TBL2）、真核翻译启动因子2亚基1α（Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Subunit 1 Alpha，EIF2S1）等20 个与PERK 相互作用的蛋白质，X-框结合蛋白1（X-Box Binding Protein 1，XBP1）、CREB 调控转录辅激活蛋白2（CREB Regulated Transcription Coactivator 2，CRTC2）、早老素1（Presenilin 1，PSEN1）等20 个与ATF6相互作用的蛋白质。每种蛋白质相互作用包括物理相互作用（Physical Interactions）、共表达（Co-expression）、相互预测（Predicted）、共定位（Co-localization）、遗传相互作用（Genetic Interactions）、通路（Pathway）和共享蛋白质结构域（Shared Protein Domains）（图3）。

图3 IRE1、PERK、ATF6 相互作用网络分析

2.4 GO 分析

IRE1 及其相关蛋白富集于内质网、线粒体等细胞组分中，具有蛋白质结合（protein binding）、蛋白磷酸酶结合（protein phosphatase binding）等分子功能，参与内质网应激反应（response to endoplasmic reticulum stress）、泛素依赖性ERAD 途径（ubiquitindependent ERAD pathway）等生物学过程。PERK 及其相关蛋白富集于胞液、细胞膜等细胞组分中，具有翻译起始因子活性（translation initiation factor activity）、RNA 结合（RNA binding）等分子功能，参与内质网未折叠蛋白反应（endoplasmic reticulum unfolded protein response）、细胞对葡萄糖饥饿的反应（cellular response to glucose starvation）等生物学过程。ATF6 及其相关蛋白富集于内质网、细胞核等细胞组分中，具有转录调控区序列特异性DNA 结合（transcription regulatory region sequence-specific DNA binding）、蛋白质异二聚化活性（protein heterodimerization activity）等分子功能，参与RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、内质网未折叠蛋白反应（endoplasmic reticulum unfolded protein response）等生物学过程（图4）。

图4 IRE1、PERK、ATF6 相关蛋白的GO 分析

3 讨论

先前研究认为[11-13]，作为在内质网应激发生中的重要反应，未折叠蛋白反应（URP）存在三种感受器，即IRE1、PERK、ATF6。在肿瘤细胞中这三种感受器可参与到肿瘤干细胞的调节与分化、免疫监视、肿瘤血管生成等方面，发挥着促进或抑制肿瘤发生发展的作用。因此，IRE1、PERK、ATF6 的靶向治疗将有希望成为肿瘤治疗的新选择。

IRE1、PERK、ATF6 在多种肿瘤组织中的表达存在上调状态。李会敏等用免疫组织化学实验证实结肠癌组织中IRE1α 表达水平显著高于癌旁组织[14]；周琲等报道PERK 在肝癌组织中高表达，在癌旁组织几乎无高表达[15]；OU 等报道ATF6 在口腔鳞癌组织中及口腔癌细胞系中表达异常增高[16]。本研究结果显示，ATF6 在舌鳞癌组织中表达高于组织学正常边缘组织及邻近正常组织，而IRE1、PERK 在舌鳞癌组织中表达与组织学正常边缘组织及邻近正常组织的差异无统计学意义。分析原因，可能与研究纳入样本数和组织异质性相关，未来需扩大样本量进一步分析。

IRE1、PERK、ATF6 与肿瘤的发生发展密切相关。KIM 等报道IRE1-JNK（c-Jun 氨基末端蛋白激酶，c-Jun N-Terminal Protein Kainse）-CHOP 信号通路可诱导胃癌发生自噬性细胞死亡，而下调IRE1 可阻断其自噬细胞死亡过程[17]。CAI 等报道在胰腺导管腺癌中癌相关成纤维细胞可以采用内皮细胞样表型，并在体内外直接促进肿瘤血管生成，这一过程是由PERK-eIF2α（真核细胞起始因子2α，eukaryotic Initiation Factor-2α）-ERK1/2（细胞外信号调节激酶1/2，Extracellular Signal-Regulated Kinase 1/2）轴调节[18]。COLEMAN 等报道结肠中ATF6 的持续肠道激活可促进失调和微生物依赖性肿瘤的发生[19]。本研究富集分析发现，IRE1、PERK、ATF6 在肿瘤的发生发展过程中可能涉及包括内质网应激在内的多个通路，需进一步通过相关实验阐明作用机制，为患者治疗提供新的思路。

IRE1、PERK、ATF6 在肿瘤预后预测方面也有报道。郭军飞等报道IRE1a 通过促进微小RNA-346（microRNA-346，miR-346）的高表达促使宫颈癌细胞顺铂耐药，使得IRE1a 高表达的患者预后不良[20]。余玉等研究发现在非小细胞肺癌中，PERK/eIF2α 通路的激活对癌细胞有一定的保护作用，抑制PERK 可以促进癌细胞的凋亡，提示PERK/eIF2α通路的激活与患者预后不良有关[21]。LIU 等通过对结肠癌患者队列的组织芯片进行分析发现，ATF6 和蛋白磷酸酶2A 癌抑制因子（Cancerous Inhibitor of Protein Phosphatase 2A，CIP2A）的高表达水平与预后不良的趋势相关，并进一步验证了CIP2A 的表达受ATF6 调节[22]。本研究结果显示，IRE1、PERK、ATF6 的表达与患者的RFS 无明显关系，但与患者的OS 密切相关，IRE1 高表达（HR=0.73，95%CI=0.55～0.97，P=0.028）、PERK 高表达（HR=0.74，95%CI=0.56～0.98，P=0.033）、ATF6低表达（HR=1.45，95%CI=1.1～1.91，P=0.0081）的患者OS 更好。关于IRE1、PERK、ATF6 在舌鳞癌中的预后价值未来还需扩大样本量进行验证。

综上所述，ATF6 在舌鳞癌组织中呈现高表达，同IRE1、PERK 与舌鳞癌患者不良预后相关。在未来抗肿瘤治疗中，IRE1、PERK、ATF6 有可能作为新的肿瘤分子标志物，为舌鳞癌的诊断和治疗提供新的思路。本研究基于大数据分析，具有一定的局限性。因此，后续还需通过设计具体实验进一步验证和阐述IRE1、PERK、ATF6 在舌鳞癌中的表达、作用及其相关分子机制。