广西酸笋特征风味化合物的研究

田玉峰,孙明浩,许家敏,黄月芳,麻志泽,马玉春,陈灿坚,刘小玲,李树波*

1(广西安全工程职业技术学院 安全工程系,广西 南宁,530100)2(广西大学 轻工与食品工程学院,广西 南宁,530004)

酸笋是以新鲜竹笋(大头笋、麻竹笋等)为原料,浸泡于山泉水、清水或低浓度盐水中,经自然发酵得到的一种传统笋用竹食材[1]。由于其良好的贮藏特性、独特的风味、较高的营养价值和药用价值等[2],深受消费者的喜爱。同时,酸笋作为广西众多特色食品的主要食材与配料,其质量和风味将决定螺蛳粉和老友粉等广西特色食品的品质和特色,进而成为广西特色民族食品健康及工业化发展的关键因素。然而,目前酸笋生产仍延续着小作坊式的传统生产模式,发酵时间长,风味差异性较大,产品质量不稳定。此外,酸笋特征风味成分结构相关研究报道较少。郑文迪等[3]基于GC-MS对广西地区酸笋和酸菜风味差异的具体挥发性成分进行了检测,在酸笋中共检出86种挥发性成分,并通过相对含量确定了40种主要挥发性成分。郭荣灿等[4]对酸笋气味物质提取方法进行了优化比较,发现顶空固相微萃取(headspace-solid phase micro extraction,HS-SPME)是萃取酸笋风味物质的最佳方法。但其酸笋中关键香气成分尚未解析透彻。目前,风味活性值(odor activity value,OAV)已作为筛选食品中关键风味物质的常用方法。但不同风味物质之间的协同或掩蔽作用会导致OAV不能准确鉴定食品中关键风味[5]。为此,气质联用-嗅觉分析(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer,GC-O-MS)[6]结合了仪器分析与感官,与OAV联用分析是较理想的风味分析方法。已成功用于酸鱼[7]、泡菜[8]、醋[9]、白酒[10]等传统发酵食品关键香气成分的筛选。例如,ZANG等[11]通过GC-O-MS结合OAV的方法鉴定出酸鱼的21种关键风味物质。LIU等[12]利用GC-O-MS结合OAV鉴定出北京烤鸭的18种关键挥发性风味物质,再根据风味重组和缺失实验验证了9种特征挥发性风味物质。针对广西酸笋关键风味成分研究不足、工业化发展受限等问题,开展酸笋特征风味解析与提升等相关研究是广西特色食品产业健康发展的共性需求及研究重点。

为此,本研究以柳州5个地区酸笋为研究对象,在比较分析不同地区样品理化性质的基础上,结合HS-SPME、OAV、感官定量描述和GC-O-MS等对酸笋的特征挥发性风味化合物进行解析,为推动酸笋发展提供理论依据和方法借鉴。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

用于酸笋理化和风味物质分析的5份样品分别采集于广西柳州市菜园农贸市场、菜园屯菜市场、石山脚公司、之味螺公司和柳城县农户,分别编号为LZ1～LZ5。正构烷烃混样标准品(优级纯,纯度>99%),Sigma公司;2,4,6-三甲基吡啶、NaCl(色谱纯,纯度>98%),国药化学试剂有限公司。

7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;FJ300-SH数显高速分散均质机,上海标准模型厂。

1.2 实验方法

1.2.1 挥发性成分的GC-MS分析

参考郭荣灿等[4]的方法,并在此基础上进行优化。将酸笋与蒸馏水按1∶1(g∶mL)混合,利用均质机匀浆,准确称取6 g匀浆液放入20 mL顶空瓶中,加入1.2 g NaCl,在50 ℃下密封搅拌30 min,插入老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头。50 ℃水浴中吸附30 min后插入GC-MS进样口,在250 ℃下解析3 min。分析色谱柱为Agilent 122-5532UIHP-INNOWAX(60 m×250 μm×0.25 μm)毛细管色谱柱。进样口温度250 ℃;载气为高纯氦气;流速1 mL/min。升温程序:初始柱温40 ℃,保持4 min,然后以6 ℃/min 升至140 ℃,保持5 min, 3 ℃/min 升至150 ℃用于1 min,5 ℃/min到197 ℃用于2 min,然后1 ℃/min 到205 ℃用于0 min,再以7 ℃/min升至240 ℃,保持15 min。MS条件:电离方式EI,电子能量70 eV,灯丝发射电流0.25 mA,检测器温度230 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,质量扫描范围40～400 u,扫描方式:全扫描;调谐文件为标准调谐。

1.2.2 定性、定量分析及OAV的计算

利用MS和线性保留指数对香气化合物进行定性,其中,NIST数据库检索过程中扣除谱图背景后检索选取匹配度大于80%的化合物。保留指数(retention index,RI)定性:在相同色谱条件下,以将正构烷烃为标准测定组分RI,与文献报道的RI进行对比定性。RI计算如公式(1)所示:

(1)

式中:TR,保留时间;x,待测组分;n和n+1, 分别为待测组分出峰前后相邻的2个正构烷烃的碳原子数。

采用内标法进行半定量,参考ZANG等[11]的方法,以2,4,6-三甲基吡啶(0.5 mL,100 mg/L)为内标物,通过比较每个化合物的峰面积与内标物的峰面积来计算样品中挥发性化合物的浓度。

OAV为某化合物质量浓度与该物质嗅觉阈值的比值,按公式(2)计算:

(2)

式中:Ci,某个组分的质量浓度,μg/L;Ti,该组分的气味阈值,μg/L。

1.2.3 GC-O-MS解析

参考ZHANG等[13]的方法,由6名食品专业相关人员记录嗅闻口流出的香气物质强度和时间,并准确对香气属性进行描述。其中香气强度分为4个等级,0表示未闻到,1表示轻微,2表示中度,3表示强度。

1.2.4 感官评定

感官分析在感官分析室中进行,室温为(25±1) ℃。挑选10位品评员(食品专业学生)进行6周共3轮的感官训练。第1轮训练中,品评员需要对风味标准品进行闻香并熟悉其香气特征;第2轮训练中,品评员以酸笋风味为基础,对广西酸笋样品多次嗅闻并进行香气描述词的收集,最终经过讨论结合相关文献筛选出重要的香气描述词;第3轮训练中,针对筛选出来的香气描述词配制不用的参比样进行香气强度训练,对品评员的香气强度打分进行矫正。评定方法为十点制感官评定法,采用以下标准:0～10表示香气强度逐渐增强,0表示香气未被察觉,10表示气味最强。所有样品均随机摆放,每个样品重复2次。

1.3 数据分析

采用Excel 2016制作风味轮廓差异图;采用SPSS 26.0软件对感官数据进行方差分析,P<0.05认为存在显著性差异;采用SIMCA 14.1进行双向正交偏最小二乘(two-way orthogronal partial least square,O2PLS)分析;采用R语言绘制酸笋感官属性与关键香气化合物相关性热图。

2 结果与分析

2.1 酸笋风味轮廓差异分析

为解析柳州地区酸笋在风味结构上的整体特征,根据感官评定数据构建酸笋感官风味轮廓图。如图1所示,从整体风味轮廓来看,酸笋酒味、霉味、腐臭味极其弱,发酵香味、刺激性气味、酸味及酸臭味较强,共同形成柳州酸笋整体风味特征。其中,LZ2发酵香味、刺激性气味及酸味较强,整体喜好度最好。因此,借助GC-O进一步对LZ2的关键风味成分进行解析。

图1 柳州酸笋风味轮廓分析

2.2 酸笋中挥发性成分鉴定和定量

由表1可知,从酸笋中经SPME-GC-MS共定性定量检测出66种主要的挥发性风味成分。挥发性化合物含量从高到低依次是酚类(6种),酸类(3种),醇类(19种),醛类(15种),脂类(6种),其他类化合物(13种),酮类(2种),萜烯类(2种)。挥发性成分总含量为(2 395.15±16.18)～(3 218.22±27.65) mg/kg。柳州不同地区酸笋中各类化合物相对含量统计结果如图2所示, 酚类[(1 750.71±5.72)～(2 049.10±52.29) mg/kg)]占62.93%～73.09%、酸类[(240.49±12.46)～(535.67±6.29) mg/kg]占10.04%～19.54%、醇类[(225.00±5.93)～(518.93±19.97) mg/kg]占8.21%～ 17.36%、醛类(30.31～195.35 mg/kg)占1.01%～6.07%,这4类化合物在酸笋中含量较高且阈值较低,是酸笋中主要风味化合物。值得注意的是,5份酸笋样品中,对甲苯酚含量最高[(1 597.56±6.27)～(1 866.97±30.01) mg/kg],可能是酸笋中最关键的风味成分。

表1 酸笋主要挥发性风味化合物的定性定量结果

图3 酸笋感官属性与关键香气化合物相关性热图

2.3 酸笋中关键香气化合物分析

GC-O是确定食品基质中香气化合物的有效工具,LZ2样品 GC-O分析检出的风味化合物香气强度值(aroma index, AI)如表3所示。但在GC-O分析中,化合物被分离和浓缩,并不能准确说明单个物质对整个香气轮廓的贡献度。而OAV是化合物浓度与其阈值的比值,表征了单一化合物对整体香气的贡献,其中OAV>10的香气物质被认为对酸笋的香气有重大贡献,重要风味化合物计算出的OAV如表2所示。本研究对整体喜好度最高,风味最为浓郁的LZ2进行GC-O分析,同时结合OAV分析鉴定了酸笋中重要香气化合物。

表2 重要风味化合物的 OAV

表3 LZ2样品中检测到不同风味化合物的香气强度值

酚类化合物是酸笋中最重要的一类香气活性化合物。GC-MS共检出6种酚类物质,在酸笋中含量高达62.93%～73.09%。GC-O可检测到的酚类共5种,这类物质AI为25.8%,是贡献香气最大的物质类群。其中对甲苯酚(103 721>OAV>88 753,AI=3)OAV和AI最高,是酸笋中最关键的香气成分之一,这与FU等[14]在台湾酸笋中的报道一致。对甲基愈创木酚(烟熏,8 583>OAV>2 931,AI=2)和4-乙基愈创木酚(烟熏,1 749>OAV>466,AI=1.8)AI值较大,且具有高OAV,对酸笋香气贡献较大。对甲基愈创木酚和对乙基愈创木酚多见于发酵豆制品,具有烟熏气味,是郫县豆瓣酱、传统发酵酱油中特征风味物质[15-16]。4-乙基苯酚(酒,794>OAV>255,AI=0.8)OAV较高,仅感知到较低的AI值,苯酚(难闻,12>OAV>1,AI=1.8)虽具有较低OAV,但AI值较高。这可能由于阈值来自于文献,与本实验实际情况有差别所致。通过GC-O结合OAV可推断4-乙基苯酚和苯酚对酸笋香气也有一定贡献。

酸类化合物主要由微生物利用淀粉、脂肪、蛋白质等有机物发生生化反应生成[5]。GC-O解析检测到乙酸(酸,AI=3)香气强度最大,对酸笋香气有突出贡献。乙酸、3-甲基丁酸和4-甲基戊酸可能以协同作用的方式形成郫县豆瓣酱中典型酸味[15]。本研究发现丙酸和辛酸以较高含量存在于酸笋,虽不能被嗅闻到,也可能会同乙酸以协同作用的方式形成酸笋中典型酸味。

醇类化合物在发酵食品中主要通过酵母发酵代谢、蛋白质分解等生成。GC-MS可检测到19种醇类物质,是酸笋中种类最多的物质。GC-O可检测到的醇类有7种,其中1-辛烯-3-醇(蘑菇,AI=2)和1-壬醇(玫瑰,AI=1.2)是醇类化合物中OAV最大的2种化合物,所属呈香属性可增强酸笋发酵香味。据报道,这2种醇对柱候酱、黄酒等发酵食品香气也有一定贡献[17-18]。苯乙醇(脂香,18>OAV>5)OAV虽较低,但AI值高(1.6),也发挥重要助香作用。其次,3-辛醇(蘑菇,AI=1)、L-芳樟醇(铃兰,AI=1)和正辛醇(柑橘=1.2)可被嗅闻到较高AI,且OAV>10,对整体风味形成具有一定贡献。乙醇具有较低的AI值(酒味,AI=0.2)和OAV,对整体风味贡献性小。

醛类化合物大多由发酵过程中放热引起不饱和脂肪酸的碳链氧化或者脱羧基而生成,容易被还原成醇类物质,虽在酸笋中含量不高,但此类物质阈值低[12]。GC-O-MS可检测到的醛类有5种,其中AI值较大的有反-2-辛烯醛(腐败,AI=2)、反-2-壬烯醛(腐败,AI=1.8)和壬醛(烤香,AI=1.6),同时,反-2-辛烯醛(6 787>OAV>1 628)、反-2-壬烯醛(82 426>OAV>0)和壬醛(4 729>OAV>258)具有高OAV,对酸笋“臭味”的形成贡献较大。这3种醛类物质也被鉴定为热鸭蛋凝胶中关键香气物质[19],反-2-辛烯醛、壬醛在肉制品及传统发酵豆制品中也发挥关键香气作用[12, 17]。正己醛(青草,AI=1.2)和庚醛(花,AI=1)能被嗅闻到,且OAV均大于10,对酸笋气味的形成也具有一定贡献。

酯类物质主要由微生物在发酵过程中经酰基辅酶A和醇乙酰转移酶的共同作用下代谢而成,以及在脂肪酶催化作用下由酸与醇反应而生成[20]。GC-O解析检测到2种酯类物质,乙酸乙酯(果香,AI=0.6)和水杨酸甲酯(冬青油香气,AI=1.8),其OAV均大于10,是酸笋中主要呈香酯类化合物。乙酸乙酯是白酒中常见的主体香气物质,如在兰陵美酒,清香型白酒等均有报道[5, 21]。由图2可知,酯类化合物在酸笋中占比较小,此类化合物主要呈酒香和果香。因此,酯类化合物在酸笋中主要是减少刺激气味、助香及缓冲平衡的辅助作用,同时还具有提高健康成分含量的作用。

其他风味化合物主要包括甲苯、乙苯、萘、2-戊基呋喃及对羟基苄基乙基醚。GC-O解析仅检测到萘(焦油,38>OAV>20,AI=1.5)具有较高AI值,对酸笋风味形成具有一定贡献。酮类化合物是脂肪氧化和降解的产物之一,风味独特,主要带有水果香、花香及霉腐味[22]。酸笋中酮类物质相对较少,1-辛烯-3-酮(蘑菇,AI=2.6,9 817>OAV>1 398)AI值和OAV较高,是酸笋中重要的酮类香气化合物。

综上所述,GC-O-MS结合OAV法确定酸笋中重要挥发性成分有:1-辛烯-3-醇、乙酸、对甲苯酚、反-2-壬烯醛、壬醛、苯乙醇,这与GUO等[23]的研究基本一致。此外,本研究还发现乙酸乙酯、水杨酸甲酯、L-芳樟醇、正辛醇、1-壬醇、3-辛醇、4-乙基愈创木酚、对甲基愈创木酚、苯酚、反-2-辛烯醛、正己醛、庚醛、1-辛烯-3-酮、萘也是酸笋重要风味组成成分。根据AI>1.5及OAV>10可进一步确定酸笋中关键香气成分为水杨酸甲酯、反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、壬醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸、对甲苯酚、对甲基愈创木酚、对乙基愈创木酚和萘。FU等[14]经GC-O-MS对台湾酸笋进行解析后,推测其特征风味是由对甲苯酚和乙酸协同产生。本研究发现对甲苯酚(AI=3)和乙酸(AI=3)含量及AI值均高于其他风味组分,因此,对甲苯酚和乙酸亦是广西酸笋香气贡献最大的6个成分。

2.4 感官属性和重要香气化合物的相关性分析

为探究酸笋感官属性与香气化合物之间潜在关联,建立O2PLS模型,分析过程中X代表重要风味化合物;Y代表感官属性,其相关性系数矩阵由R进行可视化。通过分析酸笋香气属性与香气化合物之间的关系,发现酸臭味主要与对甲苯酚(F4)、苯乙醇(C19)的浓度呈较好的相关性。刺激性气味及酸味与对乙基愈创木酚(F3)、3-辛醇(C9)具有较好的相关性。酸味属性与乙酸相关性未体现出来,可能是因为酸笋中乙酸主要形成酸笋主体风味,而对酸味差异性贡献较小。发酵香味与3-辛醇(C9)、壬醛(Q4)、反-2-辛烯醛(Q5)、1-辛烯-3-醇(C10)、L-芳樟醇(C12)及苯酚(F2)呈正相关。因此,可进一步推断醇和醛在酸笋中发挥着重要的助香作用。酒味与乙酸乙酯(Z1)、水杨酸甲酯(Z4)、萘(B10)表现出较好相关性。腐臭味与对甲基愈创木酚(F1)及萘(B10)有一定相关性。

3 结论

本论文以柳州5个地区酸笋为研究对象,基于感官定量描述对酸笋风味特征进行解析,发现酸笋主要风味属性为发酵香味、刺激性气味、酸味及酸臭味。此外,HS-SPME-GC-MS共定性定量检测出66种主要的挥发性风味成分。醛类、酸类化合物及酚类化合物对酸笋特征风味的形成有重要作用。醇类、酯类及其他类化合物在酸笋中主要起到助香,增强酸笋风味多样性的作用。GC-O-MS结合OAV筛选结果表明酸笋中重要挥发性成分为水杨酸甲酯、反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、壬醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸、对甲苯酚、对甲基愈创木酚、对乙基愈创木酚和萘。O2PLS模型进一步分析酸笋感官特性与GC-O检出的香气化合物之间的关系。结果表明,酸笋主要香气属性酸臭味主要与对甲苯酚、苯乙醇的浓度呈较好的相关性。酸味及刺激性气味与对乙基愈创木酚、3-辛醇具有较好的相关性。而发酵香味与3-辛醇、壬醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3醇、L-芳樟醇及苯酚相关性较好。本研究结果全面解析了酸笋中呈味氨基酸及关键香气化合物,将为酸笋风味品质控制及提升奠定理论指导和参考价值。