信号通路对Ilizarov技术牵张成骨调节作用的研究进展

付志斌，何国伟，陈威，谭明远，王国慧，徐玉德，周明旺

Ilizarov技术是前苏联Ilizarov教授发明的以张力应力法则为理论基础的骨外固定技术，被誉为20世纪骨科发展史上的里程碑之一[1]。随着该技术的不断推广，其在矫形外科、修复重建、颌面外科等领域中得到广泛应用。Ilizarov技术是以张力应力法则为基础的牵张成骨技术，其通过安全、缓慢的牵张，促进骨与周围组织的再生，从而达到治疗疾病的目的。牵张成骨技术在宏观上主要分为三个阶段：潜伏期、搬移期、固化期[2]，目前已有较多研究报道；其在微观上的作用机制研究也逐渐增多。尽管骨牵张的生物力学、组织学和超微结构等已经进行了深入的研究，但牵张成骨调控骨生成的分子生物学机制仍不完全清楚。大量研究证实，多个信号通路在牵张成骨的过程中具有调节作用，在机械牵张下，间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）可以特异性地迁移到成骨前沿，进行成骨细胞分化，促进新骨形成，以响应机械张力[3-5]。本文以Ilizarov技术牵张成骨为研究的主线，从骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）-Smad/整合素（integrin）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）和Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路转导途径，就信号通路对Ilizarov技术牵张成骨调节作用的研究进展进行综述，以期从信号通路转导途径探讨Ilizarov技术牵张成骨的分子生物学机制，为肢体矫形和骨修复重建外科的研究提供新的思路。

1 Ilizarov技术机械牵张激活BMP-Smad信号通路促进成骨细胞分化

BMP是一种特异性非胶原基质蛋白，是成骨细胞分化成熟的一种特异性标志物。在Ilizarov技术机械牵张促进骨形成的过程中，BMP是重要的启动因素和影响因子[6]。在骨形成早期，BMP可与MSCs表面的相应受体结合，从而刺激MSCs向成骨细胞分化，在分化的同时使成骨细胞产生更多的BMP。同时BMP激活其介导的BMP-Smad信号通路。骨形态发生蛋白受体（bone morphogenetic protein receptor, BMPR）属于转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）受体超家族成员，是膜蛋白受体，受体分子由细胞外区、跨膜区和细胞内区组成，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构，分为BMPR-ⅠA、BMPR-ⅠB和BMPR-Ⅱ三类[7-8]。BMP配体与异源二聚体结合可以激活Smad蛋白依赖性BMP信号转导途径[9]。Jun等[10]在牵张成骨的研究中发现，BMP-2、BMP-4表达水平在早期和牵张期明显增加，其可能的作用是促进前体细胞分化为成软骨/成骨细胞。

Ilizarov技术机械牵张作用不仅可以直接促进BMP的生成，而且间接刺激其他生长因子的产生，如TGF-β、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、胰岛素样生长因子（insulin like growth factor, IGF），这些因子又可以刺激MSCs分化，最终促进骨形成[11-13]。Sumanasinghe等[14]研究发现，对MSCs施加牵张力，牵张的机械张力-应力效应对BMP转录有显著影响，可以使BMP-2表达上调。朱晓文等[15]通过机械牵张介导Smad通路对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）成骨细胞分化作用的研究发现，TGF-β/Smad信号通路的激活与细胞受牵张应力刺激密切相关，并与MSCs增殖与骨向分化趋势一致。表明在Ilizarov技术机械牵张促进骨形成的过程中，BMP-Smad通路在细胞力学信号向生物化学信号转导过程中具有重要作用。

2 整合素/mTOR和Wnt/β-连环蛋白信号通路协同促进MSCs向成骨细胞分化

2.1 整合素信号通路

整合素信号通路是一系列蛋白组成的由众多信号分子参与的蛋白网。Liu等[16]提出，机械张力刺激成骨细胞系时，整合素具有一定的作用。这一发现对研究牵张成骨的分子机制具有重要意义。Spiteri等[17]提出，当细胞受到机械应力刺激时，整合素在细胞外基质与细胞骨架之间将力学信号转化为生化信号，整合素信号通路对诱导BMSCs分化及新生骨的形成起着重要的调控作用。姜喜亮等[18]通过实验抑制整合素信号通路，发现牵张成骨中BMSCs的骨向分化及成骨作用减弱，提示整合素信号通路在牵张成骨过程中具有调控作用。该课题组还在体外实验中发现整合素β1在将胞外的张应力刺激转化为胞内生化信号的过程中扮演着重要角色[19]。

2.2 mTOR信号通路

mTOR信号通路在细胞分裂及MSCs诱导分化过程中具有重要的调控功能[20]。Nakai等[21]在动物的牵张成骨实验中，应用牵张装置对截骨段施加一定的牵张力，发现骨断端间隙内成骨细胞mTOR信号通路被激活，PCR检测mTOR基因表达水平明显升高，成骨细胞功能增强，骨折愈合加快。杨子桧等[22]通过大鼠体内牵张成骨模型及体外MSCs-成骨细胞系牵张模型，发现牵张组骨断端新生骨痂中p-mTOR表达水平明显高于对照组；而且PCR结果显示，牵张组mTOR表达上调，牵张应力可激活mTOR信号通路，从而促进MSCs-成骨细胞系迁移，增强组织成骨能力。更有研究者发现，mTOR可促进MSCs的骨向分化，体内及体外应用mTOR抑制剂雷帕霉素可以抑制成骨[23-24]。体外牵张应力可激活成骨细胞mTOR信号通路，使mTOR表达水平升高[21,25]。

2.3 Wnt/β-连环蛋白信号通路

Wnt/β-连环蛋白信号通路在调控细胞增殖、分化、凋亡、存活及癌变等过程中起着重要作用，尤其在骨骼发生、再生的各个阶段。Zhou等[26]通过CKIP-1基因沉默大鼠牵张成骨研究发现，CKIP-1基因沉默可促进Wnt/β-连环蛋白信号分子的表达，诱导BMSCs成骨分化，促进新骨生成。胡静等[27]通过构建大鼠牵张成骨模型，发现Wnt信号通路的两个关键蛋白分子Wnt3A及β-连环蛋白在牵张骨痂成骨细胞中的表达明显上调，停止牵张4周后其表达水平显著降低，结果证实Wnt/β-连环蛋白信号通路参与牵张成骨全过程，机械应力刺激引起牵张间隙内生物学改变。赵闯等[28]通过分离培养大鼠BMSCs，应用自行研制的多单元细胞拉伸装置，对BMSCs予以机械张应力刺激，从而激活Wnt信号通路，发现机械牵张刺激增强BMSCs增殖与成骨分化。

2.4 信号通路的协同作用

骨折愈合是一个复杂的过程，有大量的细胞因子参与这个过程，其中BMSCs起着重要的作用，其有较强的增殖能力和向多种MSCs分化的潜能，能够向成骨细胞分化[29]。所以在骨折愈合和骨不连的研究中，BMSCs相关的动物实验及临床研究的报道较多，研究结果均证实BMSCs在骨折愈合中扮演重要的角色[30-33]。BMP是TGF-β超家族中的多功能生长因子，在MSCs形成骨祖细胞中发挥关键作用[34]。在Ilizarov技术牵张成骨中，BMP-Smad信号通路是最早发挥作用的启动通路，Wnt/β-连环蛋白信号通路是BMSCs分化的经典途径[21]，主要由细胞外分泌蛋白Wnt家族细胞膜上的跨膜受体、胞质内的降解复合体和β-连环蛋白等组成。姜喜亮等[18]发现，抑制整合素信号通路可以减弱牵张成骨中BMSCs骨向分化及成骨作用，提示整合素信号通路在牵张成骨过程中具有调控作用。研究发现，牵张应力很可能激活MSCs-成骨细胞系mTOR信号通路，使基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2、MMP-9、MMP-13的表达水平升高，进而降解细胞外基质，从而促进MSCs-成骨细胞系的迁移[22,35]。Zhao等[36]发现，整合素连接激酶（integrin-linked kinase, ILK）除了参与整合素信号通路外，还可能影响生长因子信号通路和Wnt信号通路，并且提出BMSCs对力学刺激较为敏感，恒定的微小外力可诱发BMSCs增殖分化。BMSCs在生理条件下保持静息状态，为BMSCs龛控制，而不是在组织中游离，MSCs龛以MSCs、整合素、血管内皮细胞和细胞外基质为微环境的主要成分[37-38]；在外界刺激（创伤等病理条件和应力等）可使骨组织中的BMSCs处于动态。牵张刺激使BMSCs发挥作用，主要通过扰动、影响细胞外基质刚度和改变细胞刚性三种形式，符合三种形式中的任何一种就可以使BMSCs脱龛[39]。BMSCs生物学效能的发挥以BMSCs脱龛后迁移至成骨部位为前提，从而进行成骨细胞分化，牵张应力下的牵张成骨过程同样如此[31]。根据以上信号通路的途径及作用机制可以推测，在Ilizarov技术牵张成骨的过程中，BMP-Smad/整合素/mTOR和Wnt/β-连环蛋白信号通路具有协同作用，可协同促进BMSCs成骨分化，增强牵张应力成骨的效能。

3 小结

Ilizarov技术牵张应力刺激可以促进BMSCs迁移至成骨前沿，分化形成成骨细胞，达到骨再生和修复骨缺损的作用。在这一过程中，BMP是重要的启动因素和影响因子，该因子介导的BMP-Smad信号通路也成为最先的启动通路。在Ilizarov技术牵张应力刺激下，整合素、mTOR和Wnt/β-连环蛋白信号通路均具有促进MSCs增殖与骨向分化趋势，大量的动物实验也证明此结果，但是还需要大量的临床研究进行验证。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突