胫骨横向搬移技术的临床应用及其诱导血管再生机制的研究进展

徐道非，胡蓉，余庆龙，廖龙，张滔，余琳，张定伟，石波

胫骨横向搬移（tibial transverse transport, TTT）技术基于Ilizarov技术的张力应力法则，于胫骨中上段制造搬移骨块，安装横向骨搬移外固定器，双向缓慢调整外固定器，横向搬移骨块，促进搬移区域血管再生，改善下肢血供。CT血管成像（computed tomography angiography, CTA）发现，糖尿病足患者骨搬移区域及肢体远端新生大量毛细血管[1]。TTT技术虽然已被证实可改善下肢血供、促进溃疡创面愈合、降低截肢风险、提高生活质量，但其介导血管再生的机制尚不明确，本文总结了TTT技术直接或间接刺激血管生成的潜在驱动因素，为后续研究提供参考。

1 TTT技术

1.1 TTT技术概述

TTT技术源于Ilizarov技术张力应力法则，其原理为缓慢持续向同一方向牵拉刺激牵拉区域血管、肌肉和骨的再生。TTT技术于胫骨中上段制造搬移骨块并进行持续的横向搬动，促进新生血管和骨组织形成，改善肢体血液供应，从根本上消除下肢缺血性疾病的根源，促进血液循环，从而在临床治疗中发挥作用[2]。TTT技术可促进血运重建，有效改善下肢血供，促进下肢溃疡的愈合。有研究显示TTT技术治疗Wagner 4级糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer,DFU），术后1年患者伤口愈合率和保肢率均为94.74%，血管造影显示下肢动脉增粗，血管网较前丰富[3]。与传统治疗相比，TTT技术显著提高了DFU治疗后2年的溃疡愈合率、保肢率、血管再通率、血流量等指标[4]。

1.2 血管生成

充足的血液供应在伤口愈合中起着重要作用。血管造影证实，在骨搬移的过程中，搬移区域新生了大量毛细血管[5]。血管生成定义为新的毛细血管从先前存在的脉管系统中生长出来，发生及发育的过程[6]。血管生成反应是最早被确定对伤口修复至关重要的过程之一[7]。伤口血运重建是一个主动过程，脉管系统对受伤组织的代谢需求做出反应。在许多类型愈合不良的伤口中都发现了伤口血管生成障碍，包括由于衰老、糖尿病和血管疾病引起的伤口[8]。超过100项研究检查了糖尿病患者伤口愈合中的血管生成。这些研究表明，血管生成减少是导致糖尿病患者伤口愈合不足的关键因素[9]。血管生成因子和受体的缺陷，以及内皮祖细胞（endothelial progenitor cell, EPC）数量和功能的缺陷，都被认为是导致糖尿病患者伤口中血管生成反应受损的原因[10]。糖尿病患者中发生的促血管生成阶段的缺陷已在多项动物研究中成功逆转[11]。在此类研究中，糖尿病动物模型中血管生成的改善通常与伤口闭合的改善同时发生。例如在短期实验中，添加外源性促血管生成因子已被证明可以恢复糖尿病小鼠的血管生成并改善伤口闭合[12]。除了血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）外，大量单一疗法已被证明可有效改善糖尿病小鼠模型中的糖尿病伤口愈合[11]。然而，在人类DFU中，单因素治疗的效果甚微。更具体地说，没有明确的证据表明单独使用VEGF治疗可以改善人类DFU的愈合[13]。

2 TTT技术的临床应用

2.1 TTT技术在糖尿病足中的应用

DFU是糖尿病最常见和最严重的并发症之一，超过15%的DFU会发展为下肢截肢[14]，且5年死亡率高达70%[15]。DFU是多因素造成的，其中外周动脉疾病和微血管功能障碍起着重要作用。血管病变不仅会导致足部溃疡，还会导致随后的愈合失败和截肢[16]。既往DFU的治疗包括外科清创、血运重建（血管内介入、血管旁路移植）、皮瓣移植、控制感染等。这些疗法由于技术复杂、临床适应证窄、创伤大、费用贵等原因难以在临床上取得较好效果[17]。即使经过昂贵的治疗后DFU愈合，其1、3、5年的复发率分别为40%、60%和65%[14]。

TTT技术通过持续稳定调整牵引，伴随着丰富的血管网络形成。与常规手术治疗相比，该技术有利于顽固性DFU患者的伤口愈合和保肢，并发症少且轻微，此外手术后足部可发现新生血管形成和灌注增加[18-19]。一项前瞻性多中心队列研究纳入1 175例患者，经2年随访，最终分析的1 072例患者中，94.9%的溃疡完全愈合，4.9%接受大截肢，3.1%经历复发，平均愈合时间为（12.4±5.6）周[1]。另一项多中心研究共纳入201例糖尿病足患者，随访所有患者的伤口均完全愈合，平均愈合时间为（4.6±1.6）个月，未发生大截肢、复发及治疗相关并发症[19]。TTT的治疗效果与TTT后新生血管形成和灌注增加有关。在近端胫骨牵拉期间，远端胫骨的血流量增加了7～8倍[20]。TTT技术能有效、安全地治疗2型糖尿病患者的缺血性DFU，是缺血性DFU治疗体系的重要组成部分[21-22]，值得进一步研究。

2.2 TTT技术在下肢缺血性疾病中的应用

下肢慢性缺血性疾病是由中小动静脉狭窄或闭塞引起的四肢血液循环障碍，包括动脉硬化性闭塞症和血栓闭塞性脉管炎等。下肢缺血性疾病是目前临床上导致下肢功能障碍甚至截肢的最常见原因，下肢缺血性疾病由于自身血运障碍而致长期组织缺血，在遭受外伤等情况下，常出现伤口不愈合。对下肢缺血性疾病，传统的治疗方案很难改善伤口的溃疡、感染，乃至发展到截肢。因此，改善下肢血供成为治疗下肢缺血性疾病的关键。既往将TTT技术应用于DFU的治疗，取得了显著的临床效果（溃疡愈合率和保肢率显著提高，复发率降低[18]），该效应可归因于骨搬移介导的血管生成和新生血管形成后的灌注。鉴于下肢缺血性疾病与DFU有一些重要的共同发病机制（缺血），因此推测TTT技术可能有助于下肢缺血性疾病的治疗。Nie等[23]的研究纳入85例下肢缺血性疾病患者，根据治疗方式分为TTT组（42例）和对照组（43例），TTT组患者接受TTT技术治疗后进行4周的牵引，对照组则接受传统手术（清创、血运重建、皮瓣重建、皮肤移植或同等手术），术后1年随访中评估溃疡愈合和愈合时间、保肢、复发和患者死亡率，使用CTA评估TTT组患者腿部小血管的变化，与对照组相比，TTT组创面、足部、同侧小腿处有较多新生小血管形成，患者在更短的愈合时间内获得了更高的治愈率，并缩短了愈合时间。Zhao等[24]报道了22例使用TTT技术治疗的血栓闭塞性脉管炎病例，在第一个治疗周期内实现了血栓闭塞性脉管炎相关的慢性下肢伤口愈合。两个治疗周期后所有伤口均完全愈合。经过TTT技术治疗，患者足部冷感明显缓解，下肢静息痛明显缓解，激光多普勒流量计显示患足的血流灌注和经皮氧分压均较术前升高。

两项研究分别采用TTT技术治疗不同类型下肢缺血性疾病，均取得较常规治疗更高的伤口愈合率，并缩短了愈合时间，显示血管网较治疗前更丰富，提示TTT技术在改善下肢缺血性疾病血供方面有十分积极的作用。但TTT技术介导血运重建的机制尚不清楚，现有机制研究大多依托动物模型，还需进一步扩大研究，完善TTT技术理论基础。

3 TTT技术诱导血管再生的机制

3.1 血管生成-成骨耦合

骨骼是一种高度血管化的组织[25]，损伤部位的血管供应减少和营养供应有限会导致骨骼愈合受损，这表明血管生成对于骨骼修复过程至关重要。更重要的是，越来越多的证据表明骨修复过程中血管生成和成骨过程之间存在密切的时空关联和功能依赖性，推测为血管生成-成骨耦合[26]。将骨骼系统中的毛细血管内皮细胞细分为H型和L型。H型内皮细胞的特点是高表达血小板内皮细胞黏附分子1和内粘蛋白，介导脉管系统的局部生长，并为血管周围骨祖细胞提供生态位信号，增强血管生成和成骨的耦合[27]。对于骨搬移，其特点是在牵张阶段出现血管生成，并在随后的巩固阶段出现新骨生成，这表明在骨搬移过程中存在血管生成-成骨耦合。近年来，随着对血管生成-成骨耦合作用认识的积累，骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）在骨再生中的关键作用得到进一步探讨。一方面，骨内毛细血管系统的物质供应和信号调节功能很大程度上致力于改善BMSCs的募集和成骨分化[28]；另一方面，由间充质干细胞分化而来的成骨细胞也被认为是H型内皮细胞和血管生成的重要调节细胞[29]。Shen等[30]首先证实了大鼠牵引成骨术（distraction osteogenesis, DO）模型中H型血管的存在，并发现DO模型中的H型血管更多。这是首次报道DO模型中存在H型血管，并且证明规律的拉应力可以刺激H型血管的形成。同时，包括放射、免疫组织化学和免疫荧光分析在内的体内结果表明，H型血管丰度较高的群体表现出更好的血管生成和成骨结果，这可能与H型血管介导骨血管生长的独特分子特性有关[30-31]。缓慢持续牵拉骨块可以促进BMSCs的成骨分化和促血管生成潜力，促进骨中的血管生成-成骨耦合，其机制有待在临床实践中进一步研究。

3.2 促血管生成相关因子

3.2.1 EPC

EPC与DO过程密切相关。据报道，DO将EPC从骨髓动员到外周血中，将它们引导至牵引间隙，可能有助于大鼠胫骨DO模型中的血管生成和骨再生[32]。Lee等[33]报道了接受肢体延长的患者在DO期间EPC的动员，并伴有血浆VEGF和基质细胞衍生因子1水平升高。Jia等[34]通过超速离心从大鼠骨髓EPC中分离外泌体。使用68只Sprague-Dawley大鼠建立单侧胫骨DO模型，持续牵引10 d，牵张后将内皮祖细胞来源外泌体（EPC derived exosomes, EPC-Exos）局部注射到牵张间隙中，分析评估EPC-Exos对骨再生和血管生成的治疗效果，并通过体外测定评估EPC-Exos的促血管生成作用和潜在机制。X线、CT和组织学分析表明，接受EPC-Exos治疗的大鼠的骨再生明显加速，EPC-Exos组的血管密度高于对照组。EPC在血管生成中的作用众所周知，EPC-Exos具有源自EPC的促血管生成特性[35]。Jian等[34]进行Microfil灌注和CD31的免疫化学结果显示，EPC-Exos组的牵张再生血管明显增多。同时，该研究还进行了CCK-8测定、伤口愈合测定和管形成测定，以确认EPC-Exos对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）的促血管生成作用。这些测定表明，EPC-Exos显著增加了HUVECs的增殖、迁移和血管生成能力。体内和体外结果共同支持了EPC-Exos在DO期间有效刺激血管生成的发现。由于血管生成对于DO期间的骨再生至关重要，并且与骨再生相结合，该研究进一步探讨了EPC-Exos促进血管生成的潜在机制。根据之前的研究，miR-126主要富集在EPC-Exos中，对EPC-Exos的功能至关重要，EPC-Exos的促血管生成作用依赖于miR-126；miR-126靶向SPRED-1，后者通过阻断Raf激活来抑制Ras/ERK信号传导[35-37]。以上研究表明，EPC-Exos促进糖尿病患者伤口愈合中的血管生成，并加速血管损伤后的再内皮化。

3.2.2 VEGF

TTT技术可以刺激血管生成因子的产生，从而促进新生血管生成、VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的高表达[38]。欧栓机等[39]回顾分析10例糖尿病足患者的临床资料，在指定时间抽取外周静血，ELISA法检测VEGF、bFGF、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、血管衍生生长因子（plateletderived growth factor,PDGF）水平，患者血清VEGF、bFGF、PDGF及EGF表达水平均在术后显著高于术前，在调整骨块过程中，VEGF能调整自身代谢影响血运重建。bFGF、EGF、PDGF通过旁分泌来促进VEGF表达[40]。当细胞氧传感机制检测到缺氧时，血管生成过程就会启动，从而激活促血管生成分子产生的途径。伤口中最重要的促血管生成介质是VEGF-A，约占愈合皮肤中促血管生成刺激的50%。

VEGF-A的合成位于已充分描述的缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor, HIF-1α）氧感应通路的下游[41]。HIF-1是一种二聚体，包含一个α（HIF-1α）和一个β（HIF-1β），HIF-1β也称为芳烃受体核转位子（aromatic hydrocarbon receptor nuclear translocation factor, ARNT）亚基。通过结合两个亚基，HIF-1可以调节许多控制缺氧反应的基因。在常氧条件下，HIF-1β亚基持续表达，而HIF-1α快速降解。然而，在缺氧条件下，HIF-1α会稳定下来，与HIF-1β结合，产生的HIF-1分子会激活缺氧反应（包括VEGF-A的产生）。VEGF-A虽然是伤口中主要的促血管生成因子，但大量其他促血管生成因子已被证明在伤口愈合中发挥作用，并有助于整体促血管生成环境。已被证明可补充伤口中VEGF-A促血管生成活性的因子包括FGF-2、转化生长因子β（transforming growth factor β, TGF-β）、心脏锚蛋白重复蛋白（cardiac anchor protein repeat protein, CARP）、胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor, IGF-1）、几种CXC基序趋化因子（例如CXCL8）和许多其他趋化因子[42]，需要进一步明确各细胞因子在血运重建中具体机制，为临床实践提供理论依据。

3.3 重建巨噬细胞极化平衡

糖尿病患者伤口表现出失调和持续的M1（促炎）巨噬细胞极化，而正常伤口将在受伤后第3天左右表现出向M2（促愈合）巨噬细胞的转变。在DFU创面上，巨噬细胞趋向于M1型极化，而M1型巨噬细胞数量和比例增多导致创面愈合困难[43]，Yang等[44]采用自行设计的外固定器建立了新型TTT大鼠模型，并研究其对伤口愈合的影响，使用激光散斑灌注成像、血管灌注、组织学和免疫组织化学评估伤口愈合过程。根据激光散斑成像，TTT组伤口区域的血流量高于其他组，且观察到更多的血管，CD31和α-平滑肌肌动蛋白双重免疫标记的TTT组中新血管形成增强，TTT组伤口部位的M2巨噬细胞数量也有所增加，TTT技术治疗后还观察到免疫调节反应。M1和M2巨噬细胞在组织修复的炎症和增殖阶段非常重要[45]。皮肤损伤后的3～5 d是愈合的止血和炎症阶段，此时M1巨噬细胞是最突出的细胞，首先被招募来清理伤口内的衰老细胞和碎片[46]。在研究的前9 d，TTT组与对照组伤口闭合与血流量恢复无显著差异，表明TTT技术可能主要通过诱导创面远期的血管生成进而促进创面恢复。例如，在皮肤伤口愈合的增殖阶段，TTT技术显著促进M1巨噬细胞恢复为M2巨噬细胞，M2巨噬细胞按表面标记分为M2a、M2b、M2c和M2d亚类，具有不同的分泌细胞因子和生物学功能。特别是，M2d巨噬细胞释放白细胞介素-10和VEGF，这可能将伤口愈合过程中的免疫调节功能和血管生成联系起来[47-48]。该结果表明，TTT技术能降低M1/M2比值，重建巨噬细胞极化平衡以促进创面愈合。

综上所述，在糖尿病足等下肢缺血性疾病患者中，TTT技术可有效增加下肢毛细血管网，改善血液流动，恢复肢体血供。其血管生成机制考虑为：分泌促血管生成相关因子，诱导新血管形成；重建巨噬细胞极化平衡，以M2型为主，加速血管再生；激活相关细胞因子通路，促进BMSCs向血管生成-成骨耦合等。但仍需进一步研究以提供更大样本的科学数据，为后续研究血运重建的分子机制，优化手术流程提供理论依据。

【利益冲突】所有作者均声明不存在利益冲突