基于液质联用技术的脂肪酸修饰型GLP-1类似物一级结构测定

胡馨月，孙悦，李懿，吕萍，张慧，李晶，梁成罡

目的 使用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF MS）对脂肪酸修饰型胰高血糖素-1（GLP-1）类似物利拉鲁肽和司美格鲁肽一级结构进行测定。

方法 分别在完整分子和酶切肽段水平上检测，采用ACQUITY UPLC peptide BEH C18（2.1 mm × 100 mm，30 nm，1.7 μm）色谱柱，流动相 A 为 0.1% 甲酸-水溶液，流动相 B 为 0.1% 甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱，流速0.3 ml/min；采用正离子 ESI+ 离子源和 MSE 采集模式进行数据采集。

结果 分别从完整分子和肽段水平准确测定了两种脂肪酸修饰型 GLP-1 类似物一级完整序列结构信息，并对修饰侧链位点进行准确定位。肽段覆盖率为 100%，且专属性强、重复性好。

结论 液质联用技术快速、灵敏、准确，可用于 GLP-1 类似物一级结构的表征分析。

胰高血糖素-1（glucagon like peptide-1，GLP-1）是由肠道 L 细胞分泌的促进胰岛素分泌的多肽激素，能够调节或刺激胰岛素的分泌，减慢胃肠道排空，抑制食欲[1]。生理性的 GLP-1 是亲水性多肽，几乎无法透过血脑屏障，在体内会被二肽基态酶（DPP-4）迅速灭活，半衰期很短，仅为 1～2 min[2]。随着重组 DNA 技术的发展，通过改变 GLP-1 天然结构，减缓药物的吸收和分布，延长体内半衰期，减少病人的给药次数。GLP-1 类似物具有改善血糖[3]、降低体重[4]和降低心血管风险[5]等功能。GLP-1 类似物的开发策略，主要分为 3 种：①改变氨基酸：通过改变第 8 位氨基酸，从而阻止DPP-4 的剪切；②通过引入脂肪酸链，提高药物与白蛋白的结合能力，延长在血浆中的存留时间，或者通过 GLP-1 与白蛋白或 Fc 等融合，依赖于 pH的 FcRn 介导的再循环机制，逃避内吞进入溶酶体降解，延长半衰期[6]，或与 PEG 共价结合，从而减缓肾消除；③通过皮下缓释剂型来维持血药浓度[7]。

利拉鲁肽和司美格鲁肽是利用了以上第 1 和第 2 种策略。在结构方面，利拉鲁肽与天然 GLP-1（7～37）分子相比，34 位赖氨酸被精氨酸取代，26 位赖氨酸上增加一个谷氨酸介导的 16 碳棕榈酰脂肪酸侧链（图1A）[8-9]；司美格鲁肽与 GLP-1（7～37）相比有两个氨基酸的差异，除了 34 位赖氨酸被精氨酸取代外，8 位丙氨酸被非天然氨基酸2-氨基异丁酸（Aib）取代，抵抗 DPP-4 的降解，26 位赖氨酸增加一个脂肪二酸长链（图1B）[10-11]，进一步延长其在体内的半衰期。脂肪酸侧链除了可以与赖氨酸上的侧链 NH2进行酰化反应外，还可能与利拉鲁肽和司美格鲁肽 N 端 His 上的 α 氨基和近 C 端两个 Arg 上的胍基反应，因此需要对其酰化位点进行确证。

图1 利拉鲁肽（A）和司美格鲁肽（B）结构Figure 1 Liraglutide (A) and semaglutide (B) structure

氨基酸序列（一级结构）决定了蛋白高级结构及所发挥的生物学功能，一级结构的正确与否关系到产品的安全性和有效性，是产品的关键质量属性之一。本研究用液质联用技术，以利拉鲁肽和司美格鲁肽作为 GLP-1 类似物研究对象，对其一级结构进行测定。通过 MSE采集模式同时对一级和二级碎片进行采集，包括完整分子量、完整分子和酶解肽段水平序列测定（N 端序列测定）以及脂肪酸侧链的准确定位。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 ACQUITY UPLC I-Class液质联用仪、Synapt G2-S Q TOF 液质联用仪和 UNIFI 数据处理软件均为美国 Waters 公司产品。

1.1.2 试剂 乙腈、甲酸为美国 Fisher Scientific公司产品；Glu-C 酶（1 mg/支）为美国 Worthington公司产品；利拉鲁肽和司美格鲁肽原料药为中检院激素室留样（批号：HJ1LK4012、JQ1SHP008）；贝那鲁肽国家标准品来源于中国食品药品检定研究院（批号：410020-201901）。

1.2 方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 供试品的制备 称取样品约 10 mg，用0.1% 氨水溶液定容至 10 ml，配成浓度为 1 mg/ml的样品溶液。取上述溶液 100 μl 置于 10 ml 容量瓶中，用 0.1% 甲酸/水溶液定容至刻度，混匀，作为供试品溶液。

1.2.1.2 酶切样品前处理 称取样品约 10 mg，用 50 mmol/L 的碳酸氢铵溶液溶解并定容至 10 ml，配成浓度为 1 mg/ml 的样品溶液。取该溶液 100 μl，加入 50 mmol/L 的碳酸氢铵溶液 900 μl，GLU-C酶（1 mg/ml）2 μl（蛋白和酶重量比为 50:1），37 ℃孵育 15～18 h。加入甲酸 1 μl 停止反应，作为酶切供试品溶液。

1.2.2 实验仪器方法

1.2.2.1 完整分子量和序列测定仪器方法 液相条件：色谱柱 ACQUITY UPLC peptide BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm，30 nm）；流动相 A 为0.1% 甲酸-水溶液，流动相 B 为 0.1%甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱：0～10 min，20%～70% B；10～10.5 min，70%～95% B；10.5～12 min，95% B；12～12.5 min，95%～20% B；12.5～15 min，20% B。流速 0.3 ml/min，柱温 50 ℃，进样体积 5 μl。质谱条件：液质联用仪器为 Waters UPLC I-Class/synapt G2-S Q TOF，电喷雾离子源（ESI+）正离子模式，锥孔电压：40.0 V；扫描范围：50～2000 m/z；检测模式为 MSE，碰撞能量：20～30 eV。

1.2.2.2 酶切肽段序列测定的仪器方法 液相条件：ACQUITY UPLC peptide BEH C18（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm，30 nm）色谱柱；流动相 A 为 0.1%甲酸-水溶液，流动相 B 为 0.1% 甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱：0～13 min，0%～30% B；13～19 min，30%～45% B；19～30 min，45%～70% B；30～32 min，70% B；32～32.5 min，70%～0% B；32.5～40 min，0% B。流速 0.3 ml/min，柱温 50 ℃，进样体积 1 μl。质谱条件同 1.2.2.1。

1.2.3 数据处理 Waters-UNIFI 输入理论氨基酸序列，一级质量数和二级质量数质量容差为20 ppm。利拉鲁肽序列设置 HAEGTFTSDVSSY LEGQAAK(&)EFIAWLVRGRG，& 为脂肪酸修饰，分子式 C21H37NO4（367.2723 Da）；司美格鲁肽序列设置 HOEGTFTSDVSSYLEGQAAK(&)EFIAWLVRGRG，O 代表Aib 氨基酸，& 分子式C35H61N3O12（715.4255 Da）。

2 结果

2.1 分子量检测

对 GLP-1 类似物进行 MSE一级质谱采集，经去卷积处理，利拉鲁肽实测单一同位素质量数[M+H]+为 3749.9813 Da，理论单一同位素质量数[M+H]+为 3749.9537 Da，偏差为 7.4 ppm；司美格鲁肽实测单一同位素质量数 [M+H]+为4112.1414 Da，理论单一同位素质量数 [M+H]+为4112.1227 Da，偏差为 4.5 ppm，结果表明利拉鲁肽和司美格鲁肽的分子量正确，一级质谱图见图2A和 2B。

图2 利拉鲁肽（A）和司美格鲁肽（B）一级质谱图Figure 2 Primary mass spectra of liraglutide (A) and semaglutide (B)

2.2 完整多肽二级序列测定和修饰位点定位

2.2.1 完整多肽二级序列测定碰撞能优化 对关键碰撞能参数进行考察，以期获得较多 b/y 离子数，更好地覆盖氨基酸序列。考察 10～20、10～30、20～30、20～40、30～40、30～50、40～50、50～60 eV 碰撞能下的 b/y 离子总数（每个碰撞能条件下重复进样 2 针）。结果如图3 所示，碰撞能20～30 eV 时产生的 b/y 离子数较其他碰撞能的个数相对较多，故选择 20～30 eV 碰撞能条件下进行二级采集分析。

图3 不同碰撞能条件下利拉鲁肽和司美格鲁肽的 b/y 离子数Figure 3 The total number of b/y ions of liraglutide and semaglutide at different collision energy

2.2.2 完整多肽二级序列和 N 末端氨基酸序列测定 对 GLP-1 类似物进行 MSE二级质谱采集，采用 UNIFI 软件进行处理，得到对应的 y 离子与 b 离子，b、y 离子系列相邻的离子的质量差，即氨基酸残基质量，根据互补或完整的 b/y 系列离子可以匹配氨基酸序列。经去卷积处理，利拉鲁肽氨基酸序列测定（y 离子与 b 离子）由结果（表1和图4A）可知，b/y 离子共计 56 个，肽段覆盖率为 100%，N 末端氨基酸为 HAEGTFTSDVSS YLE，该 15 个氨基酸所匹配的互补 b/y 离子至少检出一个，可表明 N 末端氨基酸序列与理论序列一致。司美格鲁肽氨基酸序列测定（y 离子与 b 离子）由结果（表2 和图4B）可知，b/y 离子共计52 个，肽段覆盖率为 100%，N 末端氨基酸为HOEGTFTSDVSSYLE（O 表示 Aib），该 15 个氨基酸所匹配的互补 b/y 离子至少检出一个，可表明N 末端氨基酸序列与理论序列一致。

表1 利拉鲁肽氨基酸序列测定（y 离子与 b 离子）结果Table 1 Amino acid sequence determination of liraglutide (y ion and b ion) data

图4 利拉鲁肽（A）和司美格鲁肽（B）二级离子覆盖图Figure 4 Secondary ions coverage of liraglutide (A) and semaglutide (B) fragments

2.2.3 完整多肽二级序列测定中修饰位点定位 利拉鲁肽氨基酸序列测定（图4A），y1～y11碎片离子和 b1～b19 碎片离子均无酰化侧链相连，酰化试剂连接位点在 y11 与 y12& 之间，b19与 b20& 之间，即 20 位 K 上。司美格鲁肽氨基酸序列测定（图4B），y1～y10 碎片离子和 b1～b19 碎片离子均无酰化侧链相连，酰化试剂连接位点在 y10 与 y12& 之间，b19 与 b21& 之间，存在两个氨基酸 KE。根据反应机制，司美格鲁肽通过序列氨基酸中的侧链基团与脂肪二酸发生定点酰化反应所得，E 不存在与脂肪二酸结合的位点，K 中侧链氨基可以与其反应，故修饰位点位于K 上。

2.2.4 专属性验证 另取贝那鲁肽适量，按照1.2.1.1 项下前处理和 1.2.2.1 项下进行采集，在Waters-UNIFI 中分别输入利拉鲁肽或司美格鲁肽理论氨基酸序列进行完整分子量和碎片离子的匹配，结果显示贝那鲁肽实测单一同位素质量数[M+H]+为 3297.6741 Da，与利拉鲁肽或司美格鲁肽理论一级分子量均不一致，故无法进一步匹配利拉鲁肽或司美格鲁肽二级碎片离子。故输入贝那鲁肽理论序列（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIA WLVKGR）进行软件解析。结果如图5，表明贝那鲁肽与利拉鲁肽或司美格鲁肽理论二级碎片均不完全一致。综上，证明该方法专属性良好。

图5 贝那鲁肽碎片覆盖离子图Figure 5 Secondary ions coverage of beinaglutide

2.2.5 重复性验证 照 1.2.2.1 项下液质方法，利拉鲁肽和司美格鲁肽分别重复进样 6 针，利拉鲁肽单一同位素质量数 [M+H]+平均值为3749.9831，RSD% 为 0.0003%，肽段覆盖率均为100%；司美格鲁肽单一同位素质量数 [M+H]+平均值为 4112.1561，RSD% 为 0.0005%，肽段覆盖率均为 100%。

2.3 酶解肽段二级序列测定和修饰位点结构及定位

2.3.1 酶解肽段二级序列测定 通过 V8 Glu-C蛋白酶进行特异性水解，利拉鲁肽和司美格鲁肽皆有 3 个 Glu 酶切位点，采用 LC-MS/MS 对水解的主要肽段分析，根据肽段序列推导氨基酸序列。利拉鲁肽和司美格鲁肽分别检测到 4 条和 5 条主要肽段（含一个漏切肽段），每条肽段的质量数、保留时间、序列和 b/y 离子数详见表3 和表4，表中显示的所有酶切肽段可全部覆盖利拉鲁肽和司美格鲁肽氨基酸序列，从而也辅助验证了完整多肽序列与理论序列的一致性。

表4 司美格鲁肽酶切质量肽图数据Table 4 Digestion quality peptide map data of semaglutide

2.3.2 酶解肽段修饰位点结构定位 根据利拉鲁肽和司美格鲁肽经酶切后肽段 3（V3&[5]+H+）质量肽图数据，显示脂肪酸侧链修饰位于该肽段中，进一步通过 LC-MS/MS 分析和 UNIFI 软件处理，该肽段的 y1 碎片离子和 b1～b4 碎片离子均无酰化侧链相连，修饰位点则位于 y1 与 y2& 之间，b4 和 b5& 之间，即 K 上（图6）。通过裂解规律分析，进一步从肽段 3 的原始二级质谱图中寻找酰基化侧链特征离子和定位特征离子。如图7 所示，信号峰 m/z 643.4276 为利拉鲁肽肽段3 的 y2& 离子，序列为 EK&；信号峰 m/z 451.3536 为利拉鲁肽脂肪酸侧链与 20 位赖氨酸K 的侧链直接相连的碎片离子。同理，如图8 所示，信号峰 m/z 991.5812 为司美格鲁肽肽段 3 的y2& 离子，序列为 EK&；信号峰 m/z 799.5058 为司美格鲁肽脂肪酸侧链与 20 位赖氨酸 K 的侧链直接相连的碎片离子。综上，通过肽段 3 的二级质谱特征碎片证明酰化侧链直接与赖氨酸侧链NH2相连。

图6 利拉鲁肽（A）和司美格鲁肽（B）肽段 3 二级覆盖图Figure 6 Secondary ions coverage of liraglutide (A) and semaglutide (B) peptide 3

图7 利拉鲁肽的肽段 3 中特征离子碎片图Figure 7 Characteristic ion fragments of liraglutide peptide 3

图8 司美格鲁肽的肽段 3 中特征离子碎片图Figure 8 Characteristic ion fragments of semaglutide peptide 3

3 讨论

随着生物质谱技术的发展，液质联用质谱法串联测定多肽及蛋白质氨基酸序列快速、灵敏、准确等特点，可以作为支撑多肽和蛋白结构分析和确证的重要手段。

通过借鉴以往在胰岛素及其类似物中一级结构的分析经验[12-13]，本研究采用了两种质谱的分析策略：自下而上和自上而下分析策略。“自上而下”是利用色谱联用质谱或质谱等分析技术，直接对完整蛋白水平分析；“自下而上”策略是使用一种或多种酶将蛋白水解成小肽再进行肽段水平的质谱分析。本研究通过 MSE模式采集利拉鲁肽和司美格鲁肽完整肽段分子的一级分子量和二级碎片离子，对该两种 GLP-1 类似物进行“自上而下”完整分子层面的一级结构分析，在碰撞诱导解离碎裂中，b 和 y 型碎片离子在质谱图中较多见，丰度较高[14]，通过互补的 b/y 离子匹配氨基酸理论序列。研究中尝试不同碰撞能量，采用 20～30 eV 的梯度碰撞电压，得到相对较多的 b/y 离子数。经数据处理分析，利拉鲁肽和司美格鲁肽的 N 端 15 个氨基酸全部匹配，肽段覆盖率均为 100%。完整肽段脂肪酸定位研究中，根据 b、y 离子系列相邻的离子的质量差，利拉鲁肽可精准判断脂肪酸修饰在20 位赖氨酸上，司美格鲁肽 EK 两个氨基酸之间则可以根据反应机制进行判断。在“自下而上”肽段水平中，所有酶切肽段可 100% 覆盖利拉鲁肽和司美格鲁肽氨基酸序列，并且通过对特征肽段二级质谱的解析，找到利拉鲁肽和司美格鲁肽脂肪酸酰化侧链直接与赖氨酸侧链 NH2相连的碎片离子。

本研究通过利用液质联用的技术，准确测定了两种脂肪酸修饰型 GLP-1 类似物一级完整序列信息结构，并对修饰侧链位点进行了准确、快速的定位，为该类药物的一级结构表征提供了参考价值，可用于研发、终产品放行过程中的结构表征方法，对该类药物质谱定性表征的标准平台化建设有一定意义。另外，不论是“自下而上”还是“自上而下”的分析策略，均可以对 N 末端氨基酸序列进行准确测定，相比于 Edman 降解法，操作更简便，灵敏度较高，具有可以替代传统 Edman 降解法的应用前景。