表面增强拉曼光谱术在乳腺癌诊断中的临床研究进展

陈泽蒙，杨晨曦，张博文，李婷

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。据统计，2020 年全球约有 226 万例新增病例，68 万人因乳腺癌死亡[1]。尽管过去几十年的研究在其预防、诊断和治疗方面已取得重大研究进展[2]，乳腺癌仍然是全球健康的主要负担之一。早期乳腺癌患者的五年生存率为 98%，而晚期乳腺癌患者的五年生存率则降至27%[3]。因此较早地发现、诊断和治疗乳腺癌对改善患者预后至关重要[4]。目前临床应用最广泛的乳腺癌影像学检测方式包括钼靶 X 线、乳腺超声和 MRI[5]，然而前两种技术的局限性是特异性低和准确性差，MRI 虽然具有较高的特异性但其价格昂贵。乳腺癌在临床诊断中的唯一金标准是病理学分析，但侵入性的手术切除或穿刺活检往往给患者造成较大的创伤。此外，乳腺组织的形态和分子异质性可能造成诊断的困难，依赖于病理学专家的经验。非侵入式、快速和具有高时空分辨率的拉曼光谱（Raman spectroscopy，RS）术正在成为乳腺癌诊断的临床研究中的强大工具，具有为乳腺癌提供临床相关诊断信息的潜力[6]。本文回顾了相关研究并介绍其基本原理、优势和相关案例。

1 表面增强拉曼光谱术原理

1928 年，拉曼发现光的非弹性散射（拉曼现象）[7]，后于 1970 年拉曼现象首次在生物医学应用中报道[8]。拉曼光谱术是一种分子振动光谱技术，可以反映分子的特征结构[9]，给出分子组成的直接、客观图像[10]。表面增强拉曼光谱（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）术克服了弱拉曼散射和荧光发射的干扰造成的低特异性的问题，利用等离子体获得附着在纳米结构表面上的分子组装物的全部化学信息[11]。SERS 增强主要通过两种机制发生：电磁增强和化学增强。电磁理论认为，当入射光落在粗糙的贵金属表面时，粗糙金属表面的等离子体吸收光子能量，进入更高的能量状态，进一步与光产生的电场耦合导致粗糙金属表面电磁场的强度增加。而化学增强主要依赖探针与金属间的化学相互作用。当活性拉曼衬底表面的 SERS 活性位点吸收探针分子，产生强大的 SERS 效应，探针和拉曼底物之间的化学键导致形成新的配合物。此外，电荷变化所产生的类共振现象增强了分子的极化率，增加拉曼散射光的强度。与拉曼光谱术相比，表面增强光谱术的特异性低至单分子水平，可提供精细的分子指纹，从而可以直接识别目标分析物，适合在多路复用检测中使用[12]。

2 表面增强拉曼光谱在乳腺癌诊断中的临床应用

表面增强拉曼光谱术具有较高的特异性和准确度，满足识别和诊断乳腺癌的临床需求，能够更快速、更可靠、更早地检测疾病，以改善患者的预后[13]。表1 总结了表面增强拉曼光谱术通过分析液体活检和体内成像的结果进行乳腺癌的检测和诊断的基本原理、优势和临床应用研究案例。

表1 表面增强拉曼光谱术在乳腺癌诊断中的临床应用

2.1 液体活检

众所周知，体液如血液、唾液和泪液在许多情况下具有多种生物标志物[20]，并且获取简单、无创，如今被越来越多地应用于乳腺癌早期检测和诊断的研究。其中，miRNA由于其在体液中的稳定性，作为用于早期诊断和预后的癌症生物标志物而受到越来越多的关注[21]。研究表明，外泌体 miRNA 生物标志物表达水平与乳腺癌之间存在密切关联[22]，因此具有成为癌症诊断、预后和治疗效果的理想生物标志物的潜力。通常，液体活检应用的目标分子包括蛋白质、核酸片段和脂质类的多种生物标志物，在临床研究中三类目标分子被联合用于早期检测和诊断乳腺癌[23]。

2.1.1 血液 2021年，Nargis 等[14]证实了基于血清的乳腺癌诊断的有效性。收集 II～IV 期乳腺癌患者和正常人的血清样本，从每个样本中获取表面增强拉曼光谱，对其进行主成分分析和偏最小二乘判别分析获得用于乳腺癌诊断和分类的光谱标志物的光谱特征，测试结果其准确度、特异性和受试者工作特征曲线下面积分别为 90%、98.4% 和 94%。2021 年，Gao 等[15]和 Lin 等[16]的研究结果表明拉曼光谱可以准确分类和区分乳腺癌患者和健康对照的血清（和血清白蛋白）。为将表面增强拉曼光谱分析用于乳腺癌的临床诊断，必须将乳腺癌与其他恶性肿瘤进行鉴别。现有研究在乳腺癌患者的血清中发现了相对于其他恶性肿瘤独特的生化特征，可以将乳腺癌与结直肠癌、肺癌、卵巢癌、口腔癌、肝癌、白血病和宫颈癌区分开来[24-25]。

2.1.2 唾液 Feng 等[26]的研究结果表明，唾液中蛋白质的表面增强拉曼光谱也具有应用于乳腺癌诊断的临床潜能。该实验采集正常对照、良性和恶性乳腺肿瘤患者的纯化唾液蛋白进行表面增强拉曼光谱分析，根据唾液蛋白的不同化学键振动确定了六个突出的峰，而三组之间大多数峰的强度存在显著差异。另外，2011 年，Oztürk 等[18]发现唾液酸水平升高与乳腺癌存在相关。通过对健康和乳腺癌患者的唾液样本应用表面增强拉曼光谱术来量化唾液酸水平的研究表明，健康样本的中位唾液酸浓度（3.5 mg/dl）显著低于乳腺癌样本中观察到的唾液酸浓度（18.5 mg/dl）[27]。

2.1.3 泪液 泪液成分除了伴随眼部疾病的产生而变化以外，也会随全身性疾病（包括乳腺癌）的发生而改变[28]。与其他体液相比，泪液的成分相对简单[29]，因此高特异性的表面增强拉曼光谱术可以用来检测其中的低丰度成分。Kim 等[19]使用便携式拉曼系统和基于多变量统计的识别算法从人类眼泪中检测或预测无症状乳腺癌，检测乳腺癌临床准确度和特异性分别达到 92% 和 100%，验证了其临床应用的潜能。

2.2 体内成像

目前已有多项研究应用便携式手持拉曼光纤探头对离体的癌性和非癌性乳腺组织进行分类[30]，证明了术中诊断乳腺癌的体内应用的潜在临床应用能力。然而尚缺乏临床应用的报道，因此本部分主要介绍表面增强拉曼光谱在离体乳腺癌肿瘤样本和活体模型动物中的体内成像研究。

2006年，Haka 等[31]报道了第一个来自乳房组织的体内拉曼光谱，样本从接受部分乳房切除术的患者身上获得。使用临床拉曼系统和光纤探头，对切除后剩余肿瘤腔的手术切缘进行评估，将结果与传统组织病理学评估的结果进行比较时，拉曼的总体准确度达到 93%。2021 年，Wen 等[32]使用纳米探针将光声成像与表面增强拉曼光谱术结合，引导手术切除小鼠乳腺恶性肿瘤并在术中切除残留微肿瘤，在乳腺癌模型鼠中实现了微肿瘤的完全消融，且后续未出现局部复发。

经皮从乳房获取拉曼光谱的可行性在小鼠模型中已被验证[33-34]，基于表面增强拉曼光谱术的体内成像动物研究也广泛开展。Pal 等[35]设计了一种具有生物相容性的三模态纳米探针，对三阴性乳腺癌鼠模型进行验证，结果表明该探针优先集中于肿瘤内，且具有出色的光声、荧光和表面增强拉曼成像能力。2023 年，Qiu 等[36]对雌性乳腺癌裸鼠模型静脉注射含有表面增强拉曼光谱探针的溶液，体内成像的结果与处死后 HE 染色和 Masson 染色结果一致。同时，解剖后获得的器官未出现明显的毒性，这表明了表面增强拉曼光谱术的生物安全性。

2.3 乳腺癌的 SERS 特征

2.3.1 乳腺癌 4 个亚型的 SERS 特征 乳腺癌根据基因和免疫组化不同分出的 4 个亚型分别为：luminal A 型、luminal B 型、HER-2 过表达型、三阴型。Xie 等[37]的研究将一种有监督的深度学习算法——人工神经网络（ANN）与血清 SERS 结合对乳腺癌的 4 种亚型进行分类，具有100% 的预测准确率，同时给出可以将 4 种亚型区分的SERS 特征。在三阴型、HER-2 过表达型、luminal B 型和luminal A 型中，SERS 在 668 cm-1（鸟嘌呤、胸腺嘧啶）、732 cm-1（腺嘌呤）、858 cm-1（酪氨酸环）、933 cm-1（对称拉伸主干 C-C、α-螺旋）、1010 cm-1（对称环苯丙氨酸）、1078 cm-1（链条 C-C 拉伸）、1169 cm-1（C-C、C-N拉伸）、1335 cm-1（腺嘌呤、鸟嘌呤）、1442 cm-1（CH2形变）、1513 cm-1（C=C 拉伸）以及 1580 cm-1（酰胺 II）处的峰值依次减弱。

2.3.2 同一亚型乳腺癌不同阶段 SERS 特征 乳腺癌根据不同发展阶段可分为 I～IV 期。2021 年，Nargis 等[14]在不同乳腺癌阶段观察到了可以将其区分的 SERS 峰，这些 SERS 特征包括 737cm-1[DNA、色氨酸、d（环）]，766 cm-1（胞嘧啶和胸腺嘧啶的环形模式），784 cm-1（胞嘧啶），950 cm-1（氨基酸的单键拉伸），1191 cm-1（L-缬氨酸），1313 cm-1（脂质的 CH3CH2扭曲模式），1424 cm-1[脱氧核糖（B、Z 标记）]、1542 cm-1（酰胺 II）、1628 cm-1（L-丝氨酸）。括号内的生物分子即乳腺癌的疾病生物标志物，因为它们主要存在于乳腺癌患者的血清样本中，而在健康人的血清样本中不存在或微量。在乳腺癌的第 II 阶段进展至第IV 阶段的过程中，在 752 cm-1（DNA、鸟嘌呤），848 cm-1（氨基酸的单键伸缩振动），932 cm-1（骨架 C-C、α-螺旋），1074 cm-1[甘油三酯 C-C（脂质）]，1245 cm-1（酰胺 III），1280 cm-1（胶原蛋白），1292 cm-1（胞嘧啶），1355 cm-1[鸟嘌呤（N7、B、Z 标记）]，1365 cm-1（氨基酸、色氨酸），1445 cm-1（蛋白质、胶原蛋白的 CH2弯曲模式），1472 cm-1（鸟嘌呤），1558 cm-1（色氨酸），1583 cm-1（苯丙氨酸的 C=C弯曲模式），1738 cm-1（脂质）处的 SERS 峰值逐渐升高，即该生物标志物的含量逐渐增加。并且处于疾病的第 III 和第 IV 期，血清中被检测出含有大量的脂质、DNA 和蛋白质，这是临床晚期乳腺癌阶段。而健康人样本的血清中出现729 cm-1（腺嘌呤环），893 cm-1（骨架、C-C 骨架），1137 cm-1（n(C-C)-脂质、脂肪酸）和 1457 cm-1（脱氧核糖）SERS 峰值，在乳腺癌患者血清的 SERS 曲线中未体现。不过目前仍缺乏进一步的研究来清楚地解释以上现象。

2.3.3 乳腺癌治疗前后 SERS 特征 Lin 等[38]对比了乳腺癌手术治疗前后的患者和健康人间血清 SERS 曲线。研究结果表明，术后组在 496 cm-1（苯丙酮）、1004 cm-1（D-甘露糖）和 1132 cm-1（次黄嘌呤）处显示出明显较低的 SERS 峰值，在 725 cm-1（L-精氨酸）处则显示出较高的强度，表明 L-精氨酸的百分比有所下降，苯丙酮、D-甘露糖和次黄嘌呤相对于血液样本中总拉曼活性成分的百分比增加。此外，另一方面，在术前组（即乳腺癌患者）的血清中 496 cm-1（L-精氨酸）、638 cm-1（酪氨酸）、1004 cm-1（苯丙氨酸）、1132 cm-1（D-甘露糖）和 1658 cm-1（酰胺 І）处 SERS 峰发生的显著变化与正常组相反。该现象是由于随着恶性肿瘤的出现和发展，凋亡和坏死的细胞会由于被动机制释放蛋白质和游离核酸，或者由活的癌细胞主动释放这些物质来影响远处易感细胞的转化。当肿瘤组织被血液和淋巴液灌注时，该蛋白质和核酸片段进入循环系统，在循环血液中产生独特的特征[39-40]。当恶性肿瘤经手术切除后，这些癌症特异性物质的来源立即被切断，最终导致术后患者的血液成分与术前不同。

3 总结与展望

表面增强拉曼光谱术的高准确度和特异性为乳腺癌的临床检测与诊断研究带来了启发。基于生物标志物 miRNA采集血液、唾液、泪液等体液应用表面拉曼光谱术进行液体活检对于患者几乎无创，经过合理的临床转化后可以成为非常理想的乳腺癌筛查和检测手段。乳腺癌切除手术过程中结合表面拉曼光谱术进行体内成像辅助检测和定位乳腺恶性肿瘤，切除残留微肿瘤，在临床角度对于患者预后和防止疾病复发意义重大。然而表面增强拉曼光谱术也存在一定局限性。虽然现有的技术可以从生物样本中获得光谱，但研究标准尚未得到统一，如样本的制备方式、安装样本的基板、光谱仪的设置及数据处理算法，不同分析流程可能使得相同的样本产生显著不同的光谱，这导致表面拉曼光谱术在临床应用转化方面仍存在一定困难。因此，制订规范化的分析流程和相关标准是很有必要的。