Ag-HA/TiO2抗菌剂的制备及在大黄鱼中的应用

李超群， 石 娟， 周丽萍， 王 晴， 娄永江

（宁波大学 食品与药学学院，浙江 宁波 315832）

大黄鱼肉嫩味鲜，富含蛋白质、维生素及微量元素等，是我国六大优势养殖水产品和主要海产经济鱼类之一[1-3]。 海水鱼在内源性酶降解、脂肪氧化和微生物作用下，极易腐败变质，其中微生物生长及代谢起决定性作用[4]。 随着人们生活水平的提高，食品安全性已成为各国普遍关注的重大问题，为了避免食物致病菌威胁人体健康，研发绿色、高效、环保的抗菌剂对海产品的鲜度保持、储存和销售有着十分重要的意义[1，5]。 生物抗菌剂的有效成分含量低、天然成分提取难度大、成本高[6]，因此探索安全有效的新型复合无机抗菌剂正成为研究热点，但目前相关报道还较少。

在自然界中很多金属离子具有抑制和杀灭微生物的作用，其中银离子在所有金属离子中抗菌能力最强，浓度低、效果好、安全无毒[7]。 载银羟基磷灰石（AgHAp）在医学和陶瓷等抗菌处理中广泛应用，且有研究证明载银羟基磷灰石（AgHAp）具有缓释性、抗菌持久性和生物安全性等特点[8-10]，但目前还需进一步探索银纳米材料新的应用领域。

由于银价格昂贵，在光照和紫外线条件下其抗菌效果会降低，导致载银羟基磷灰石的应用受到很大限制[5]。 二氧化钛（TiO2）作为食品添加剂和抗菌剂[11-13]，具有光催化能力，成本低，不但可以杀死绝大多数的微生物，还能降低有机污染，在杀菌的过程中不消耗自身体积，具有持久的抗菌性能[14]。综合AgHAp 和TiO2两者的优点， 将银离子与二氧化钛结合在一起，当没有光或紫外线时，银离子单独发挥抗菌作用；当有光或紫外线时，不仅二氧化钛能发挥光催化作用杀死细菌， 而且银离子也能抗菌，因此可制备一种兼具光催化抗菌和金属抗菌功能的新型抗菌剂，既可以降低银含量，同时又能获得更加高效持久的抗菌效果[5，15]。

作者采用贻贝壳制备的AgHAp 和Ag-HA/TiO2抗菌剂，首先通过X 射线衍射（XRD）、傅里叶红外光谱（FTIR）和电感耦合等离子体发射光谱（ICPOES）观察载银羟基磷灰石/二氧化钛（Ag-HA/TiO2）的结构表征， 并探讨了贻贝壳AgHAp 和Ag-HA/TiO2的抗菌性能，以期研究载银羟基磷灰石加入二氧化钛后对其结构和抗菌效果的影响。 选用2 种常见的水产品特定腐败菌 （SSOs）——荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌，研究载银羟基磷灰石/二氧化钛是否对SSOs 菌群有抗菌效果， 以及载银羟基磷灰石/二氧化钛抗菌材料对大黄鱼中微生物变化的影响，旨在提高贝壳的资源利用率和产品附加值， 为Ag-HA/TiO2抗菌剂在水产品保鲜领域上的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料以贝壳为原料自制的球形羟基磷灰石，送中国科学院宁波材料技术与工程研究所检测为纯羟基磷灰石。

1.1.2 实验菌种大肠杆菌 （Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、腐败希瓦氏菌（Shewanella baltica）、 荧 光 假 单 胞 菌（P.fluorescens）：均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.3 实验试剂LB 液体培养基、LB 固体培养基、NA 培养基、PCA 培养基： 杭州微生物试剂有限公司；硝酸银（AgNO3）、二氧化钛（TiO2）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

涡旋仪MX-S：美国Scilogex 公司；X 射线粉末衍射仪（XRD）：D8 Advance，Bruker 公司；智能型傅里叶红外光谱仪（FTIR）：Nicolet 6700，美国Thermo Fisher 公司； 电感耦合等离子体发射光谱仪（ICPOES）：SPECTRO ARCOS 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 AgHAp 和Ag-HA/TiO2 的 制 备4 g HA 加入100 mL 水，超声波分散，加入100 mL 质量浓度为2 g/L 的硝酸银，常温反应7 h，过滤，去离子水洗涤，60 ℃烘干，研磨过300 目筛得载银羟基磷灰石。有光条件下制得灰黑色AgHAp 粉末样品， 避光条件下制得棕黄色AgHAp 粉末样品。

将5.3 g 的TiO2加入4 g HA，静置24 h，去离子水清洗，避光环境下加入50 mL 质量浓度为2 g/L的硝酸银反应7 h，洗涤烘干，研磨过300 目筛制得Ag-HA/TiO2复合材料样品。

1.3.2 表征方法

1）XRD 标 识X 射 线、Cu-Kα 辐 射， 波 长0.154 06 nm，电压40 kV，电流40 mA，扫描范围5°～90°，每步扫描时间为0.2 s，温度20 ℃，相对湿度50%。 使用高分子样品架将样品用平板玻璃压平，X 射线衍射仪测量。

2）FTIR 溴化钾（KBr）压片，扫描范围4 000～400 cm-1，扫描次数为32 次/min。

3）ICP-OES 将制得的样品各取0.5 g，根据国标法溶解于100 mL 稀硝酸（V硝酸∶V水=5∶95）中，溶解后取1 mL 定容到250 mL，之后用ICP-OES 测试溶液中元素的浓度[16]。

1.3.3 Ag-HA/TiO2 的抗菌性测定

1）AgHAp 和Ag-HA/TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能 分别取10 mg 的灰黑色和棕黄色AgHAp、Ag-HA/TiO2、 山梨酸钾放入10 mL试管中备用，另准备空白试管做对照[17]。 用0.9 g/dL的生理盐水制备菌悬液，进行10 倍稀释法，选择2～3 个适宜稀释度， 取1 mL 菌悬液加入上述试管中。将上述试管在200 r/min、37 ℃的摇床中摇动2 h，取0.1 mL 涂布平板，放入37 ℃恒温箱中培养24 h，计菌落总数。

式中：I 为抑菌率，%；C0为空白组实验中的细菌数量，CFU/mL；C 为样品组实验中的细菌数量，CFU/mL。

2）Ag-HA/TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度（MIC） 用0.9 g/dL 的生理盐水制备105CFU/mL 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌悬液，放入4 ℃冰箱中备用[9]。取0.04 g 的Ag-HA/TiO2抗菌材料放入试管中，然后加入2 mL 营养培养液，超声处理使其充分混合，将悬浊液进行连续6 次两倍稀释， 另准备空白试管， 只加入1 mL 营养培养液，然后在每支试管中加入0.05 mL 的菌悬液。将上述试管置于37 ℃、200 r/min 的摇床中培养18～24 h。在培养结束前1 h 停止摇晃，使悬浊液沉淀，将加抗菌粉体的试管与没有加抗菌粉体的试管做对照，处理液浊度和对比液浊度相等的体系中抗菌剂的质量浓度即为MIC。

1.3.4 Ag-HA/TiO2 对SSOs 菌种的抗菌性能测定选用2 种在水产品中常见的优势细菌——荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌， 分别取10 mg Ag-HA/TiO2、山梨酸钾放入10 mL 试管中备用，另准备空白试管做对照。用0.9 g/dL 的生理盐水制备菌悬液，采用10 倍稀释法， 选择2～3 个适宜稀释度， 取1 mL菌悬液加入上述试管中。 将上述试管于200 r/min、30 ℃的摇床中摇动0.5、1.0、1.5 h。 从上述试管中取0.1 mL 涂布平板，放入30 ℃恒温箱中，培养24 h，计菌落总数，抑菌率计算同上。

1.3.5 Ag-HA/TiO2 对大黄鱼抑菌性能测定将若干相同质量的大黄鱼肉块置于0、0.125、0.25 g/dL的Ag-HA/TiO2悬浊液中浸泡5 min， 以及在0.125 g/dL 的Ag-HA/TiO2悬浊液中浸泡0、5、15、25 min，取出沥净水分，按不同的浸泡方法分别装入多个无菌封口袋中，并置于4 ℃条件下。 根据GB 4789.2—2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》分别测试1、3、5、7 d 下的菌落总数。

1.4 数据处理

XRD、FTIR、ICP-OES 的数据为中国科学院宁波材料技术与工程研究所测试中心获取。 使用Origin 9.0 及SPSS 进行作图和数据分析处理， 每组实验重复3 次，图中不同字母代表样品存在显著性差异（P＜0.05）。

2 结果与讨论

2.1 XRD 表征分析产物结构

如图1 所示，AgHAp（样品a、样品b）的XRD图谱与HA 图谱很相似，在2θ 为26°、32°、34°、40°、47°和50°附近都有其特征峰，2 个图谱比较相近，说明载银后羟基磷灰石仍然保持原有的晶形结构[18]。Ag-HA/TiO2（样品d）也都有羟基磷灰石的特征峰，说明也保持了原有的晶形结构， 但TiO2特征峰2θ为32°，与HA 的特征峰重叠了，说明钙离子部分被银离子取代，导致晶格常数增大[9]。

图1 样品a、b、d 的XRD 图谱Fig.1 XRD patterns of samples a, b and d

2.2 FTIR 表征定性分析

图2 为AgHAp （样品a、 样品b）、Ag-HA/TiO2（样品d）的红外图谱。 在AgHAp 光谱图中，在3 440、1 636、1 443、1 037、862、604、566 cm-1处存在明显吸收峰， 其中566、604、862、1 037 cm-1处的吸收峰为PO43-振动引起；在1 443 cm-1产生的分裂峰可能由于碳酸进入羟基磷灰石内部造成，是由于空气中的二氧化碳进入反应体系中，替代羟基磷灰石中的羟基产生[19]；在1 636、3 440 cm-1处的吸收峰为羟基—OH 吸收峰。 这些都说明AgHAp 基本结构是由羟基磷灰石架构组成。

a：灰黑色AgHAp；b：棕黄色AgHAp；d：Ag-HA/TiO2。

在HA 同时载银和TiO2后，其吸收峰光谱吸收峰位置并没有发生明显改变，但在862 cm-1处的吸收峰消失，604 cm-1和566 cm-1处的吸收峰强度明显减弱并且呈宽化的趋势，主要是由于PO43-振动峰与TiO2（600～400 cm-1） 的耦合振动产生， 说明AgHAp 和TiO2复合效果较好[5]。

2.3 ICP-OES 表征测定元素质量分数

根据吕国玉[5]和冯晋阳[20]等的研究，不管在光照还是无光的情况下，AgHAp 中银离子的质量分数一般在3.00%左右。Ag-HA/TiO2中银离子的质量分数为1.76%，钛离子的质量分数为31.5%，银离子质量分数明显降低。

2.4 Ag-HA/TiO2 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能

2.4.1 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果图3 为不同实验材料作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌结果。 AgHAp（样品a、样品b）和Ag-HA/TiO2（样品d）的抗菌效果与山梨酸钾有显著性差异，AgHAp 和Ag-HA/TiO2之间没有显著性差异，但是灰黑色的AgHAp（样品a）抗菌效果略弱于棕黄色的AgHAp（样品b）和Ag-HA/TiO2，说明银离子在光照条件下变色导致抗菌效果减弱。 样品a 对大肠杆菌的抑菌率为（98.04±0.78）%，对金黄色葡萄球菌的抑菌率为（99.58±0.32）%；样品b 对大肠杆菌的抑菌率为100%， 对金黄色葡萄球菌的抑菌率为（99.67±0.47）%，与其他研究中钙磷盐和银离子制备的AgHAp 抗菌效果接近[21-22]，说明贝壳粉AgHAp可以代替钙磷盐AgHAp，达到提高贝壳资源利用率和节约成本的作用。 可以看出，Ag-HA/TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均为100%， 说明其抗菌效果没有因为银离子质量分数的降低而减弱， 且TiO2的加入使银离子和TiO2发挥协同作用获得了更好的抗菌效果，不仅增强抗菌性，还可能由于TiO2对光的吸收作用抑制银离子的变色，进一步延长Ag-HA/TiO2的抗菌持久性。

图3 不同抗菌粉体对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌效果Fig.3 Antibacterial effects of different antibacterial powders on Escherichia coli and Staphylococcus aureus

2.4.2 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度 （MIC）Ag-HA/TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC 值均为312.5 μg/mL， 测试数据符合日本抗菌协会制定的《银等无机抗菌剂的自主规格及其抗菌试验法》中规定的无机抗菌剂抗菌性能要求，MIC 值小于800 μg/mL[5，23]。 在实际应用中，高载银量一方面会提高生产成本，不利于工业化生产。 另一方面可能会造成银离子超标，引起重金属污染[23]，因此尽量降低载银量。

2.5 Ag-HA/TiO2 对荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌的抑菌效果

图4～5 为Ag-HA/TiO2和山梨酸钾对荧光假单胞菌和腐败希瓦氏菌抑菌率的柱状图。 可以看出，样品对菌种的抗菌效果随着作用时间的增长没有显著性差异， 但Ag-HA/TiO2的抗菌效果明显比山梨酸钾的抗菌效果要好。而Ag-HA/TiO2与荧光假单胞菌的作用时间为0.5 h 时抑菌率为（97.58±3.43）%，1.0 h 和1.5 h 时抑菌率为100%； 与腐败希瓦氏菌在3 个不同作用时间的抑菌率均为100%。 实验样品的菌落总数显著低于对照样品，表明Ag-HA/TiO2抗菌剂对这2 种水产品特定腐败菌有很强的抑菌作用，有望成为一种较理想的水产保鲜材料。

图4 不同作用时间下样品对荧光假单胞菌的抑菌率Fig.4 Inhibition rate of samples against Pseudomonas fluorescens under different treated time

图5 不同作用时间下样品对腐败希瓦氏菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of samples against Shewanella putrefaction under different treated time

2.6 Ag-HA/TiO2 处理对大黄鱼中微生物的影响

鱼死后，随着冰藏时间的延长，其体内微生物的增长和繁殖是导致鱼肉腐败变质的主要原因，因此，在贮藏过程中检测鱼肉中微生物动态变化能够反映鱼体新鲜程度[24]。 如图6 所示，在贮藏初期，3组的菌落总数相差不大， 随着贮藏时间的加长，0 g Ag-HA/TiO2处理后菌落总数在第7 天为（5.34±0.1）lg （CFU/g），增长最快；0.125 g Ag-HA/TiO2处理后的菌落总数在第7 天为 （5.06±0.05） lg （CFU/g）；0.250 g Ag-HA/TiO2处理后的菌落总数在第7 天为（4.8±0.04） lg （CFU/g），增长最慢，菌落总数也明显低于其他2 组， 说明在浸泡作用时间同为5 min 的情况下，随着Ag-HA/TiO2质量的增加，抑菌效果变好。0 g 与0.125、0.250 g Ag-HA/TiO2处理后的大黄鱼具有显著性差异，Ag-HA/TiO2处理后大黄鱼抑制细菌生长效果明显。 参考标准规定一级鲜肉菌落总数小于4 lg （CFU/g），0 g Ag-HA/TiO2浸泡的大黄鱼在第1 天菌落总数为（4.23±0.04） lg （CFU/g）的情况下，0.25 g Ag-HA/TiO2浸泡的大黄鱼第5 天菌落总数为（3.87±0.15） lg （CFU/g），未超过4 lg （CFU/g），延长了一级鲜肉货架期[25-27]。

图6 不同质量Ag-HA/TiO2 处理后大黄鱼贮藏期间菌落总数的变化Fig.6 Changes of the total number of colonies of large yellow croaker treated with different content of Ag-HA/TiO2 during storage

由图7 可以看出， 随着冰藏时间的延长，Ag-HA/TiO2浸泡时间越长抑菌效果越好。 浸泡时间为0 min 时，在大黄鱼菌落总数为（4.16±0.06）lg （CFU/g）的情况下，浸泡15 min 时第1 天菌落总数为（3.84±0.04） lg （CFU/g），符合一级鲜肉标准；浸泡25 min时第5 天菌落总数为（3.70±0.09） lg （CFU/g），仍未超过一级鲜肉标准， 与在0.250 g 的Ag-HA/TiO2中浸泡5 min 时延长货架期的效果相同。

图7 Ag-HA/TiO2 处理不同时间大黄鱼后贮藏期间菌落总数的变化Fig.7 Changes in the total number of colonies of large yellow croaker treated with Ag-HA/TiO2 for different time during storage

由图6～7 可以看出， 经过Ag-HA/TiO2浸泡液处理过的大黄鱼与未经过处理的大黄鱼菌落总数有明显差异，菌落总数在1～5 d 抑菌效果明显，且随着质量和时间的增加， 在3～5 d 菌落总数甚至开始出现下降的情况， 证明在这段时间内Ag-HA/TiO2抑制和杀灭细菌的效果最好。

3 结 语

为了降低AgHAp 的银离子质量， 同时又能获得高效的抗菌性，将AgHAp 和TiO2结合起来，制备的Ag-HA/TiO2的银离子的质量分数降低为1.76%，负载银和TiO2后HA 晶体结构没有发生明显变化；贝壳AgHAp 的抗菌效果与钙磷盐AgHAp 抗菌效果接近，解决传统上钙磷盐成本大和废弃贝壳污染环境的问题；Ag-HA/TiO2对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率均为100%， 最小抑菌质量浓度均为312.5 μg/mL， 效果优于AgHAp；10 mg/mL Ag-HA/TiO2作用0.5 h 时对假单胞菌和希瓦氏菌的抑菌率分别为（97.58±3.43）%和100%，作用时间1.0、1.5 h时抑菌率均为100%，抑菌效果强；Ag-HA/TiO2能抑制大黄鱼中细菌的生长， 延长一级鲜肉的货架期，为食品安全问题提供了有效途径，但其保鲜能力还需进一步研究。