不同贮藏条件下芹菜可溶性糖质量分数及相关基因变化分析

贾 敏， 朱胜琪， 王雅慧， 谭杉杉， 刘洁霞， 陶建平， 熊爱生*

（1.南京农业大学 作物遗传与种质创新利用全国重点实验室，江苏 南京 210095；2.南京农业大学 园艺学院，江苏 南京 210095）

芹菜是伞形科一种重要的二年生绿叶菜类[1-2]。芹菜富含维生素、膳食纤维、类胡萝卜素和芳香物质等，具有良好的保健和药用功效，生长最适温度为15～20 ℃[3-4]。 芹菜于汉代被引入我国，距今已栽培驯化2 000 多年，历史悠久，品种繁多[5]。

可溶性糖作为调节植物体渗透压的重要物质之一，可以帮助植物抵抗许多胁迫因子[6-7]。 可溶性糖与环境因子比如温度、光照等都有一定的关系[8]。研究表明，光照贮藏下芫荽和蕹菜叶片中还原糖质量分数在贮藏期内持续增加并高于同期的黑暗处理[9]。 甘薯可溶性糖质量分数随贮藏时间逐渐增加，其增加速度与贮藏温度密切相关[10]。 低温可以降低采后糯玉米可溶性糖质量分数的下降速度，且5 ℃时下降速度最慢[11]。糖代谢过程中涉及多种酶，其中蔗糖磷酸合酶 （sucrose phosphate synthase，SPS）在植物组织中广泛存在。 SPS 催化6-磷酸果糖产生的6-磷酸葡萄糖经蔗糖-6-磷酸磷酸酶（sucrose phosphate phosphatase，SPP）催化产生蔗糖。 研究发现，将玉米SPS 基因在烟草中过表达后，植株蔗糖含量明显增加[12]。拟南芥的相关研究表明，SPSA1 和SPSA2 是拟南芥蜜腺分泌花蜜必不可少的基因[13]。作为植物中同化CO2形成蔗糖的一个关键点，SPS活力大小随蔗糖积累量的增加而增大[14]。 在蔗糖分解为己糖的过程中， 参与的酶主要有蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS） 和 蔗 糖 转 化 酶（sucrose invertase，IVR）。 其中SS 在植物代谢反应中促使蔗糖合成为果糖， 多数植物中至少包含2 种SS 同工酶，它们在基因调控上差异明显，并且具有发育情况和器官种类的特异性。 IVR 的功能是催化蔗糖水解为其他糖类，且此类反应通常被称为一种不可逆的反应[15]。 高媛媛等发现番茄叶片中的一个转化酶基因可能参与番茄花蕾糖分代谢过程[16]。研究发现，温州蜜柑和柠檬果实的蔗糖中性转化酶活性随着成熟逐渐降至最低[17-18]。 这些结果说明，蔗糖转化酶不仅参与了植物生长发育的调控，还对果实品质有一定影响，是评价其风味的一项重要指标[19]。 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 （uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UDPG） 是形成蔗糖的物质之一， 也参与合成酚类物质的C6-C3-C6骨架，二者互相影响对UDPG 的结合[20]。此外，多数UDPG 被消耗用来组成木质素的碳骨架[21]。

作者选取‘四季小香芹’和‘六合黄心芹’为研究材料，‘四季小香芹’叶片鲜绿有光泽，叶柄颜色嫩绿且实心，具有早熟、抗病、商品性好、产量高等特点。 ‘六合黄心芹’为南京六合地区的优良地方品种，叶柄黄绿色、空心、品质高，心叶金黄色，具有晚熟、抗性强、适应性好、产量较高等特点。 将其置于室温（25 ℃）、低温（4 ℃）和室温黑暗（25 ℃）条件下， 测定贮藏至0、6、24、30、48、54 h 的可溶性糖质量分数，并通过实时荧光定量PCR 技术检测可溶性糖代谢相关基因（AgIVR1、AgSPP、AgSPS、AgSS1 和AgUDPG）的表达水平，以期为提高芹菜采后品质、科学贮藏芹菜提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以南京及江苏大部分地区主要种植的小芹菜品种‘四季小香芹’和优良地方品种‘六合黄心芹’为试验材料，挑选大小一致的种子，浸种催芽，播到装有基质的塑料盆中，生长65 d 后进行处理。 选取生长状况大致相同的芹菜分别置于室温（25 ℃）、低温（4 ℃）和室温黑暗（25 ℃）条件下生长，长至0、6、24、30、48、54 h 时分别取样。 取样部位为叶片和叶柄，一部分用于叶绿素的测定，另一部分用于RNA的提取，每个样品进行3 次重复。

1.2 可溶性糖测定

可溶性糖质量分数测定参照王学奎等的实验方法[22]。称取样品约0.5 g 溶解于体积分数80%的乙醇中，80 ℃水浴30 min，冷却后离心，再次浸提。 取浸提液于沸水浴上蒸干，用蒸馏水重新溶解，离心后取上清液，测其在620 nm 的吸光度。

1.3 总RNA 提取及cDNA 的合成

参照RNA Simple Total RNA Kit （Tiangen，北京） 试剂盒说明书提取RNA， 并按照Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa，大连）试剂盒说明书将提取的总RNA 反转录成cDNA。

1.4 引物设计

依据芹菜基因组数据库获得芹菜可溶性糖代谢通路相关基因[23-24]。 利用Primer Premier 6.0 软件设计芹菜可溶性糖代谢通路相关基因的特异性正反引物。 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 引物序列分别为AgIVR1-F：5′-ACGGTTCTCA GCAAGTTC-3′；AgIVR1-R：5′-CAGATGGAGTTAT CACAATGG-3′。 AgSPP-F：5′-CTTGCTTGCCTCCA CTAA-3′；AgSPP-R：5′-GCCTATGCTAACACCTGA T-3′。 AgSPS-F：5′-TCATCATCATCATCGTCAGT-3′；AgSPS-R：5′-GTCAAGTAGCATATCCTAAGC-3′ 。AgSS1-F：5′-CCACAGTATTCTTCGTTCCT-3′ ；AgSS1-R：5′-ATTCTGCGTGTTCCATTCA-3′ 。AgUDPG-F：5′-GAAGGAACATCTACGAGGAA-3′；AgUDPG-R：5′-ACACCACAGCCATTCTTG-3′。内参基 因 为 actin， 引 物 序 列 为 Agactin -F：5′ -CTTCCTGCCATATATGATTGG-3′；Agactin-R：5′-GCCAGCACCTCGATCTTCATG-3′[25]。

1.5 实时荧光定量PCR 和数据分析

实时荧光定量PCR 参照SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa，大连）说明书，反应在Bio-Rad 荧光定量PCR 仪CFX96 上进行。 PCR 反应体系及反应程序参照贾丽丽等的实验步骤[26]，用Excel 2010和SPSS 20.0 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同贮藏条件对芹菜可溶性糖质量分数的影响

如图1 所示， 以贮藏0 h 的可溶性糖质量分数为对照，‘四季小香芹’叶片和叶柄中可溶性糖质量分数随贮藏时间的增加上下波动。 室温黑暗条件下，叶片中可溶性糖质量分数始终高于低温和室温贮藏条件。 除贮藏后30 h，室温黑暗条件下芹菜叶柄中可溶性糖质量分数均高于另两种贮藏条件。 室温与低温条件相比，前者叶片中可溶性糖质量分数基本高于后者，但差异不显著。 贮藏后24、30、54 h时，低温条件下叶柄中的可溶性糖质量分数均高于室温条件，差异不显著。

图1 不同贮藏条件下‘四季小香芹’可溶性糖质量分数Fig.1 Soluble sugar mass fraction of ‘Sijixiaoxiangqin’ under different storage conditions

由图2 可知，‘六合黄心芹’叶片和叶柄在低温条件下贮藏30 h 时的可溶性糖质量分数均显著高于室温和室温黑暗条件。 叶片和叶柄中可溶性糖质量分数也存在一定差异。 当贮藏至54 h 时，3 种贮藏条件下可溶性糖质量分数差异显著，在室温黑暗条件下叶片中的可溶性糖质量分数最高，其次是低温条件。贮藏至24 h 和54 h 时，在室温条件下放置的芹菜中叶柄可溶性糖质量分数最高，与另两种贮藏条件下的可溶性糖质量分数差异显著。

图2 不同贮藏条件下‘六合黄心芹’可溶性糖质量分数Fig.2 Soluble sugar mass fraction of ‘Liuhehuangxinqin’ under different storage conditions

2.2 ‘四季小香芹’叶片中可溶性糖代谢相关基因的表达分析

以‘四季小香芹’ 贮藏0 h 的基因表达量为对照，不同贮藏条件下叶片中可溶性糖代谢相关基因的表达水平见图3。AgIVR1 表达量随时间的增加大体呈下降趋势，贮藏后48 和54 h 较为明显。室温条件下，AgIVR1 在6 h 和54 h 表达量与其他贮藏条件相比均最低。 AgSPP 表达量随时间的增加呈先下降后上升趋势，低温和室温黑暗条件下的表达量相近， 均显著高于室温条件。 随着贮藏时间的增加，AgSPS 表达量持续下降。 AgSS1 在室温条件下贮藏6 h 的表达量最高；在室温黑暗条件下，贮藏48 h 时其表达量显著上调；低温条件下贮藏54 h 时，表达量显著上升。在整个贮藏过程中，AgUDPG 表达量整体先上升后下降。 在贮藏前期（6 h），室温和低温条件下AgUDPG 表达量上调明显。 贮藏至54 h 时，低温条件下AgUDPG 表达量显著高于其他2 种贮藏条件。 在室温黑暗下放置48 h 后，AgUDPG 基因近乎不表达。

图3 ‘四季小香芹’叶片中可溶性糖代谢相关基因的相对表达量Fig.3 Relative expression levels of genes related to soluble sugar metabolism in the leaves of ‘Sijixiaoxiangqin’

2.3 ‘六合黄心芹’叶片中可溶性糖代谢相关基因的表达分析

以贮藏0 h 的基因表达量为对照， 不同贮藏条件下‘六合黄心芹’叶片中可溶性糖代谢相关基因的表达水平见图4。 随着贮藏时间的增加，AgIVR1表达量上下波动。 在贮藏后期（48 h 和54 h），低温和室温黑暗条件下AgIVR1 表达量较高。 整个贮藏过程中，3 种贮藏条件下AgSPP 基因的表达量基本都高于对照。 在贮藏后期，室温条件下AgSPP 表达量上调明显，与‘四季小香芹’相异。AgSPS 表达量随贮藏时间的增加整体呈下降趋势。 贮藏48 h 时，AgSPS 在室温黑暗条件下表达量最高。 贮藏54 h时，3 种贮藏条件下AgSPS 表达量都极低，几乎不表达。AgSS1 在室温条件下贮藏至6 h 的表达量最高。在低温条件下，随着贮藏时间的增加，AgSS1 贮藏至54 h 的表达量显著上调。 AgUDPG 在贮藏后期的室温条件下表达量极低，几乎不表达。 在贮藏后期，低温和室温黑暗条件下AgUDPG 表达量较高，且室温黑暗条件下的表达量显著高于低温条件。

图4 ‘六合黄心芹’叶片中可溶性糖代谢相关基因的相对表达量Fig.4 Relative expression levels of genes related to soluble sugar metabolism in the leaves of ‘Liuhehuangxinqin’

3 结 语

可溶性糖是蔬菜中一种重要营养物质，其含量多少是影响果蔬采后品质的重要因素[27]。 可溶性糖作为果实风味的判断标准之一，其组分含量特征与果实风味联系紧密[28-29]。 蔬菜中可溶性糖包括葡萄糖、果糖和蔗糖等。 本研究中2 种芹菜叶柄可溶性糖质量分数均高于叶片，‘四季小香芹’可溶性糖质量分数高于‘六合黄心芹’，芹菜中可溶性糖质量分数存在品种和组织差异性。 ‘四季小香芹’在室温黑暗条件下，可溶性糖质量分数基本高于另两种贮藏条件。 顾振新等在蕹菜和芫荽的贮藏试验中发现，光照条件下植物体内还原糖的含量高于同期的黑暗处理组[30]，这与本研究结果存在一定差异，可能与贮藏条件的光照强度和糖种类有关。 本研究可溶性糖在不同温度条件下无显著变化。 彩叶草在（10±2）℃、（15±2） ℃、（20±2） ℃下可溶性糖质量分数的变化不明显，这与本研究结果一致[31]。

作者选取的5 个关键基因在可溶性糖积累过程中发挥重要作用。 在植物生长发育过程中，SS 至关重要[32]。 研究表明，SS 能调控淀粉的生成，在玉米皱缩（sh1）突变体的蔗糖转变为淀粉的过程中，淀粉的含量受SS 活性正调控[33]。 有研究报道马铃薯的SS 活性被抑制时，植株中淀粉含量和总产量呈下降趋势[34]。 在本研究中，低温贮藏至54 h 时，2 种芹菜AgSS1 的表达量都显著上升，说明AgSS1 可能在低温贮藏的后期发挥作用。SPS 存在于植物各个部位，是蔗糖参与各种生化反应的关键酶之一。 实验证明甘蔗茎中SPS 的活力与蔗糖的含量成正比[35]。 蔗糖的形成受SPS 的正调控，而蔗糖含量则随淀粉的积累而减少[14]。 对网纹甜瓜而言，花后5～25 d 内，SPS活性持续偏低，蔗糖积累极少，而花后30 d 后，SPS活性显著增加，蔗糖积累呈现上升趋势[36]。在本研究中，不同贮藏条件下2 种芹菜的AgSPS 表达量整体都呈下降趋势， 说明在芹菜贮藏过程中可能由AgSPS 前期的大量表达来促进蔗糖质量分数的增加。

随贮藏时间的增加，本研究中3 种贮藏条件下‘四季小香芹’AgSPP 表达量基本都低于对照，而‘六合黄心芹’则都高于对照。 IVR 不仅与糖的代谢和转化有关，还与植物的生长发育有关。 研究发现，在4、10、15、20 ℃的贮藏温度下，‘云薯105’马铃薯的蔗糖转化酶活性随贮藏时间的延长呈先上升后下降的趋势[37]。 研究发现，胡萝卜中反义酸性IVR的遗传转化使植株发生明显的表型变化，且该变化出现在发育的早期阶段[38]。‘四季小香芹’AgIVR1 表达量随贮藏时间的增加呈下降趋势，说明‘四季小香芹’中AgIVR1 可能在贮藏前期发挥主要功能。作为蔗糖合成的底物，UDPG 在蔗糖合成过程中发挥重要作用。 2 种芹菜的AgUDPG 在贮藏后期于室温条件下表达量极低，几乎不表达。

综上所述， 在室温黑暗条件下，‘四季小香芹’叶片和叶柄中可溶性糖质量分数高于低温和室温贮藏条件。 在低温条件下，‘六合黄心芹’叶片和叶柄中总可溶性糖质量分数高于室温和室温黑暗条件。 因此，在对可溶性糖要求较高的条件下，‘四季小香芹’宜在室温黑暗条件下短期贮藏，‘六合黄心芹’宜在低温条件下短期贮藏。 芹菜中可溶性糖积累量及可溶性糖代谢相关基因的功能存在多样性，并且芹菜中可溶性糖质量分数的积累涉及复杂的调控网络，单个基因表达量与可溶性糖质量分数之间不一定存在直接联系，不同基因之间可能通过互作共同调节芹菜贮藏过程中可溶性糖质量分数的变化，具体的作用机制需进一步探究。