高效液相色谱-蒸发光散射法测定虫草头孢菌粉中D-甘露醇*

温才洁，张志舟，蔡建华，梁柳泳，林 扬，潘灿盛，张 飞

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省保健食品功效成分检测与风险物质快速筛查工程技术研究中心，广东 广州 510070)

冬虫夏草真菌属于子囊菌纲，麦角菌科，虫草属[1-2]。它主要分布在我国西藏、青海、甘肃、贵州、四川、云南等高寒地带，是我国特有的名贵滋补强壮的药用类真菌[3-4]，其气微腥、味稍苦，性甘平，且具有增强免疫力、化痰止咳、保护肝脏及肾脏、抗肿瘤、降低血糖、调节心血管、促进造血、抗菌、抗病毒抗惊厥和对神经系统的镇静等作用[5-6]，在医生上主要是用于治疗虚弱咳嗽、气喘咯血、腰酸背痛、急性肾功能衰退、慢性肾炎及支气管炎、高血脂、肿瘤和心率失常等多种临床疾病[7-9]。

近年来由于野生虫草过度采摘导致虫草数量急剧下降，为了弥补天然虫草资源的不足，人工培育虫草的研究逐渐兴起[10]。虫草头孢菌粉先由北冬虫夏草中分离得到虫草菌和蝙蝠蛾拟青霉菌种，再经过人工发酵培养后过滤、干燥获得的子实体[11-12]。虫草头孢菌粉含有丰富的虫草酸、氨基酸、虫草素、虫草多糖和微量元素等活性物质，其中虫草酸是其主要活性成分之一[13]。虫草酸又称D-甘露醇，具有增强机体免疫力，提高血浆渗透压，利尿和减轻局部组织水肿等作用[14]。目前，测定D-甘露醇的方法有液相色谱法、液质联用法、离子色谱法、气相色谱法和分光光度法等[15-20]。其中分光光度法和离子色谱法干扰比较大，操作过程比较繁琐，灵敏度不高等缺点，无法准确测定样品中的甘露醇，测定的结果往往比真实值偏高；液质联用法虽然定性比较准确，但是测定实际样品的含量准确性不高；气相色谱法可以测定甘露醇的含量，但是由于甘露醇挥发性比较低，难以气化，因此必须要对甘露醇样品进行酯化或者硅烷化等处理，才能进一步检测，在此过程中容易改变被测样品的组分性质。本实验采用高效液相色谱-蒸发光散射测定虫草头孢菌粉中甘露醇的含量，针对虫草头孢菌粉中D-甘露醇的检测并没有现行有效的标准方法，而且虫草头孢菌粉基质复杂，容易干扰D-甘露醇的测定。针对上述问题，本研究选用糖分析柱，优化流动相的梯度洗脱程序，建立了高效液相色谱-蒸发光散射测定虫草头孢菌粉中D-甘露醇的分析方法。该方法可有效降低样品基质的干扰，准确度高，能为相关产品质量控制提供方法参考。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪-蒸发光散射检测器，美国安捷伦科技有限公司；JYL-C022E料理机，九阳股份有限公司；BSA224S电子天平，北京赛多利斯科学仪器公司；FB15067型超声波清洗器，美国 Fisherbrand公司。

D-甘露醇(99.7%)，上海诗丹德标准技术服务有限公司；乙腈(色谱纯)，美国 Honeywell公司；虫草头孢菌粉，市场；一级水，自制。

1.2 标准溶液配制

标准储备液：称取适量D-甘露醇于25 mL容量瓶中，加一级水超声溶解后定容至刻度，配得质量浓度为4.00 g/L的储备液。系列标准工作液：用一级水将标准储备液逐级稀释成质量浓度为2.00，1.00，0.400，0.200和0.100 g/L的系列标准工作液。

1.3 样品前处理

将虫草头孢菌粉混合均匀后，准确称取适量样品(约含D-甘露醇25 mg)于50 mL容量瓶中，加入45 mL一级水，摇匀超声40 min，冷却至室温后定容至50 mL，经0.45 μm滤膜过滤上机。

1.4 色谱条件

色谱柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A相)-水(B相)，梯度洗脱：0～1 min，A为80%；1～16 min，A由80%降至55%；16～16.1 min，A由55%升至88%；16.1～20 min，A为80%；流速1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度35 ℃；氮气(N2)流速1.60 SLM。

2 结果与讨论

2.1 样品提取方法

目前甘露醇的提取方法有加热回流、超声提取、涡旋震荡等方法，由于加热回流操作比较繁琐、对温度的要求相对较高，实验耗时比较长，提取效果受环境温度等多个因素的影响，其中温度影响比较大，温度控制不好，提取效果就不太理想，涡旋震荡很难对虫草孢子粉里面的细胞进行破碎提取，因此提取效果一般。使用超声提取法提取甘露醇时，相对其他方法提取效果最好，且超声提取法最为简便快捷、准确度相对比较高，易操作，自动化程度比较高，受外界的环境以及温度的影响比较小。由于甘露醇易溶于水，微溶于醇，不溶于醚，水能快速地渗透到虫草头孢菌粉中的细胞内，因此选用水进行超声提取样品中的甘露醇，就能够实现理想的提取效果。

2.2 色谱行为

精密移取供试样液10 μL，按照1.4仪器工作条件进行测定D-甘露醇标准溶液和虫草头孢菌粉供试液，所得色谱图见图1，D-甘露醇出峰时间为10.0 min。由图1可知D-甘露醇色谱峰形良好且无杂质干扰。

图1 标准和样品色谱图

2.3 检测器的选择及优化

D-甘露醇紫外吸收较弱，需选用通用型检测器[21]，一般首选蒸发光散射检测器或示差折光检测器。由于示差折光检测器受外界坏境影响比较大(如压力、温度等)，灵敏度不高，系统平衡时间比较长，基线波动较大而且不适用于梯度洗脱，蒸发光检测器受上述因素影响较小而且适用于梯度洗脱。因此选定蒸发光散射检测器，蒸发光散射检测器主要要考虑漂移管温度和载气流速两大重要因素，漂移管的温度会影响检测器的响应，温度升高，流动相的蒸发慢慢趋于完全，仪器信噪比升高，但是过高的温度会导致某些组分局部气化，仪器信号响应变差。雾化器的液滴形成会受雾化器载气的流速影响，液滴形成的大小从而会影响检测器的响应，仪器的信噪比会随着载气的流速的增加而升高，当选择漂移管温度35 ℃；氮气(N2)流速1.60 SLM时基线噪音最低，仪器的基线相对平缓。

2.4 色谱柱的选择

D-甘露醇是属于极性化合物，使用C18来分离时，甘露醇在色谱柱上几乎未能被保留，所以常见的反相色谱C18不适合用来测定甘露醇含量，在色谱柱选择上应该选择极性较为中等的柱子，由于氨基柱极性相对C18色谱柱来说比较弱，其固定相上的氨基可与甘露醇选择性作用，从而达到其他杂质完全分离的效果，减少干扰，因此本文选用氨基柱进行分析测定虫草头孢菌粉中甘露醇的含量，结果表明甘露醇在1.4的色谱条件下，分离效果比较好。

2.5 流动相的选择及优化

蒸发光检测器使用时，为了延长检测器以及色谱柱的寿命，尽量避免选用含有盐的流动相，因此选用乙腈和水作为流动相，在实验过程中发现，流动相的乙腈的比例会直接影响色谱上的保留时间和分离效果，当采用等度洗脱时，分析耗时过长，难以在短时间内对甘露醇进行更好的分离，因此在实验过程中采取梯度洗脱，经过多次试验证明梯度洗脱条件为：0～1 min，A为80%；1～16 min，A由80%降至55%；16～16.1 min，A由55%升至88%；16.1～20 min时，可以有效地在20 min以内达到比较好的分离度，并且样品在此梯度洗脱条件下可以得到较好的分离度和测定效果。

2.6 柱温优化

甘露醇在室温18～28 ℃条件下组分不能得到更好的分离，色谱峰峰型比较差，经过多次试验验证，当柱温在35 ℃时，对甘露醇的分离效果最好。

2.7 方法考察

2.7.1 系统适应性试验

分别取标准溶液、供试品溶液和空白溶液10 μL，在1.4的色谱条件进行测定，实验结果表明，甘露醇在此条件下与其他组分干扰峰能达到基线分离，分离效果良好。

2.7.2 线性关系

以D-甘露醇系列标准工作液质量浓度的自然对数为横坐标(X)，对应色谱峰面积的自然对数为纵坐标(Y)绘制标准曲线，求得线性回归方程为：Y=1.72X+4.81，相关系数为0.999 5，可知D-甘露醇在0.100～2.00 g/L范围内线性良好。当称样量为2.0 g，定容体积50 mL时，以信噪比为3时，求得检出限为1.0 g/kg。

2.7.3 精密度试验

取D-甘露醇0.400 g/L的标准溶液上机测定，重复进样6次，测得峰面积的RSD为3.6%，表明仪器精密度良好。

2.7.4 重复性试验

称取同一批样品，平行制备6份供试液进行测定，求得D-甘露醇测定值RSD为5.8%，表明该方法重复性良好。

2.7.5 加标回收试验

称取虫草头孢菌粉6份平行样，分别加入低、中和高3个质量浓度的标液，n=2，求得加标回收率和相对标准偏差RSD见表1。由表1可知，D-甘露醇的回收率为93.5%～97.5%。

表1 加标回收试验

2.8 实际样品

采用本方法对8种实际样品进行分析测定，测定结果见表2。

表2 实际样品检测结果

3 结 论

本试验建立了虫草头孢菌粉中D-甘露醇的高效液相色谱-蒸发光散射分析方法。本方法对检测器、色谱柱、流动相、柱温等条件进行优化考察，最终结果表明采用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色谱柱进行分离，以乙腈/水为流动相，进行梯度洗脱，柱温为35 ℃的条件下测定虫草头孢菌粉中甘露醇的含量可有效减少样品基质干扰，确保结果准确可靠和高灵敏度。本试验方法可为甘露醇质量的控制提供科学的检测依据，从而为规范人工冬草夏草的种植及加工工艺的选择提供依据，同时也可为其他糖类化合物的测定提供技术借鉴。