新型甲醛检测荧光探针的构建与表征*

樊 鑫，朱梦月，李云行，杨明利，李飞飞，赵军军，吴 云，侍慧慧

(1 南京医科大学康达学院药学部，江苏 连云港 222000；2 江苏豪森药业集团有限公司，江苏 连云港 222000；3 江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222000)

羰基活性物质(RCS)是常见的氧化应激代谢产物，并且该代谢产物已经被证实与多种疾病相关，如癌症、糖尿病、肝脏疾病和心血管疾病等[1-4]。甲醛(FA)是最简单的具有式H-CHO的醛类，是一种反应性羰基化合物，一直被视为人类毒素和致癌物质。环境中的甲醛一般分为天然来源(如生物质燃烧、腐殖质、植被与微生物排放等)和人为来源(车辆排放等)。甲醛是一种无色的带有刺激性气味的气体，它不仅具有活泼的化学性质，而且还具有较强的生物活性，被广泛用作许多工业材料和化学品的重要前体化合物，如其40%的水溶液又称福尔马林溶液，在医学上常用作消毒剂和防腐剂。但是，甲醛真正进入我们的生活和生产是从大量的使用建筑材料、涂料、装潢材料以及粘结剂的时候开始的[5]。

甲醛是具有较高活性的内源性代谢产物，在细胞内生理浓度范围约为0.1～0.4 mM[2]，内源性甲醛可通过多种酶促反应产生(如脱甲基酶或氧化酶等)。甲醛作为一种最简单的醛，在正常的情况下，我们自身体内有完整的代谢机制，一般可以通过酶促反应将甲醛降解转化为甲酸、CO2以及水，因此，活生物体中甲醛的浓度一般是保持在从低到高毫摩尔的动态平衡范围内。但甲醛超标对人体是有害的，甲醛浓度异常升高会诱导多种疾病的产生，如神经退行性疾病、慢性肝脏疾病、癌症和心脏疾病等[2，4]。

对于生物体来说，甲醛也被列为高毒性复合生物体，因为它与蛋白质，核酸的强相互作用或受其他生物分子影响会导致其生物活性失活。人体处于外源性甲醛过量的环境中将对健康造成显着威胁。人体吸入过量的甲醛后会导致中枢神经系统受损，诱发癌症甚至死亡[6]。内源性甲醛的异常集聚、代谢失衡会引起甲醛应激反应，通过引发DNA错误交联及蛋白质的错误折叠、异常修饰从而产生细胞毒性[7]。到目前为止，研究人员已经证实许多疾病的病理进程和甲醛浓度变化密切相关。例如，在患阿尔茨海默症小鼠的脑组织中，研究人员观察到甲醛浓度异常升高，高浓度的甲醛能够诱导β淀粉样蛋白错误折叠积聚并引起τ蛋白过度磷酸化，从而损伤神经网络，最终导致记忆力减退和认知障碍[8-9]。因此，清除神经元和大脑组织中过多的甲醛在一定程度上能防止神经病变，治疗神经退行性疾病[10]。实现甲醛高效率、高灵敏度及特异性的检测将有助于我们深入理解甲醛相关疾病的发病机理，从而发展出新的医学方法用于神经退行性疾病等甲醛相关疾病的治疗[11-12]。

在过去的几十年中，研究人员已经开发出多种检测甲醛的技术，主要包括高效液相色谱法(HPLC)[13]、紫外可见分光光度法(UV-vis)[14]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[15]和电化学检测技术[16]。然而，色谱所用仪器价格昂贵，操作复杂，对操作人员的要求较高。分光光度法操作简单，但对样品的要求较高。电化学检测方法重复性差，导致数据偏差大。

与之相对的，通过结合荧光显微镜技术，使用荧光成像小分子荧光探针来研究活体生物系统中的生物物质的方法，由于其高时空分辨率、无创性、高灵敏度、强特异性等优点[17]，可在不同的生物环境中更直接和更容易地监测甲醛。然而，能高效且选择性地实时监测活组织中的FA活性的探针仍然较少。

由于甲醛含有高反应活性的羰基结构，所以氨基是最常用的荧光探针识别基团[18-19]。目前已报道的甲醛探针根据识别基团的不同大致可以分为以下3类[20]：(1)以氨基(-NH2)为识别基团，与甲醛反应后形成亚胺产物，导致荧光信号改变[21]；(2)以肼(-NH-NH2)为识别基团，与甲醛反应后形成亚甲基肼基团，导致荧光信号改变[22]；(3)以高烯丙基胺为识别基团，与甲醛发生Cope重排反应生成醛或者酚产物，导致荧光信号改变[23]。

基于此，我们设计了一种新型的荧光探针F-4，以期实现高灵敏度、高选择性的检测FA的目的。此探针以邻苯二胺为识别基团，探针分子内存在光诱导电子转移(PET)过程，猝灭了荧光团的荧光，故而探针自身荧光微弱，在与FA反应后，PET机制被阻断，恢复了荧光团的荧光，荧光发射波长红移，且荧光强度增强。

图1 探针F-4 的结构组成及作用原理

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

400YH核磁共振波谱仪，日本JEOL；Agilent-6410 LC/MS液质联用仪，美国Agilent公司；Delta 600/2489高效液相色谱仪，美国Waters公司；色谱柱，5C18-AR-II(4.6 mm×250 mm)，COSMOSIL；UV-2450紫外分光光度计，Shimadzu；FL-4600荧光光度计，Hitachi；LGJ-10D冷冻干燥机，北京四环科学仪器有限公司；AY120电子天平，日本岛津公司；WH-3涡旋混合仪，上海泸西分析仪器厂有限公司；CHA-S气浴恒温振荡器，江苏正基仪器有限公司；柱层析硅胶(200～300目)，安徽良臣硅源有限公司。

其他试剂和溶剂均为分析纯或化学纯，购自实验谷平台。

本文中所合成的部分中间体化合物和目标化合物均进行了核磁(NMR)以及质谱(ESI-MS)表征。所有的1H NMR和13C NMR都是由JEOL 400 MHz检测。溶解化合物所用的氘代试剂(CDCl3、DMSO-d6)均以四甲基硅烷为内标；1H NMR和13C NMR的化学位移δ单位为ppm；耦合常数单位为Hz；用不同的字母表示化合物裂分的氢谱信号峰。

1.2 探针合成

图2 探针F-4的合成路线

(1)化合物F-1的合成

将4-氯-3-硝基肉桂酸(1.8 g，7.91 mmol)，CuCl (24 mg，0.24 mmol)和NH3·H2O(10 mL)的混合物置于压力罐中。将其置于120 ℃的电热鼓风炉中20 h。 反应完成后，将固体残余物溶于水中，将残余CuCl固体滤出。用3 M HCl调节pH至7，有大量固体析出，过滤，滤渣用水洗涤，干燥，将固体通过柱色谱法纯化(PE∶EA=2∶3)，得砖红色固体1.11 g，产率为67.5%。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ 8.20 (d，J=2.0 Hz，1H)，7.86～7.78 (m，3H)，7.52 (d，J=15.9 Hz，1H)，7.04 (d，J=8.9 Hz，1H)，6.35 (d，J=15.9 Hz，1H).13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ 168.25，147.73，143.15，134.11，130.43，127.63，122.45，120.46，116.97. MS (ESI)calculated for C9H8N2O4：208.17；found：m/z207.0[M-H]+。

(2)化合物F-2的合成

将碘代二苯碘乙酸酯(837 mg，2.6 mmol)和四乙基溴化铵(546 mg，2.6 mmol)溶于无水二氯甲烷(15 mL)并在室温下搅拌5 min。之后，加入化合物F-1(500 mg，2.4 mmol)，并在室温下反应4 h。TLC监测反应进程，反应结束时，混合物用水稀释并依次用10% NaHSO3(3×20 mL)，10% NaHCO3(3×20 mL)，水(2×20 mL)和饱和NaCl(2×20 mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，旋干。粗产物通过柱色谱法纯化(PE∶EA=5∶1)，得到橙色固体360 mg，产率为61%。1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ 8.03 (d，J=2.1 Hz，1H)，7.34 (dd，J=8.7，2.1 Hz，1H)，7.02～6.93 (d，1H)，6.77 (d，J=8.7 Hz，1H)，6.66 (d，J=14.0 Hz，1H)，6.15 (s，2H)；13C NMR (101 MHz，CDCl3)δ 144.32，135.02，132.82，125.61，123.94，119.39，105.48. MS (ESI)calculated for C8H7BrN2O2：242.0；found：m/z243.0[M+H]+。

(3)化合物F-3的合成

将化合物F-2(50 mg，0.2 mmol)和4-(N，N-二甲基氨基)苯基硼酸盐(41.4 mg，0.2 mmol)溶于无水甲苯(15 mL)。 加入四(三苯基膦)钯(3.46 mg，1.5% mmol)，四丁基溴化铵 (64.4 mg，0.6 mmol)和3 M K2CO3(3 eq)。 将反应混合物在氩气保护下于80 ℃搅拌6 h。TLC监测反应进程，反应结束后，将溶液用2 M盐酸中和，将反应混合物真空浓缩，用乙酸乙酯稀释，饱和NaCl溶液(2×20 mL)洗涤，无水Na2SO4干燥，旋干。固体通过柱色谱法纯化(PE∶EA=3∶1)，得到黑色固体360 mg，产率为61%。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ 7.96～7.91 (d，1H)，7.69～7.64 (dd，1H)，7.44 (s，2H)，7.29 (d，2H)，6.84 (m，3H)，6.65 (d，2H)，2.85 (s，6H)；13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ 150.30，145.76，133.28，130.56，127.75，127.32，126.57，125.63，122.86，122.63，120.29，112.80，40.51. MS(ESI)calculated for C16H17N3O2：283.1；found：m/z284.2[M+H]+。

(4)化合物F-4的合成

将化合物F-3(500 mg，1.77 mmol)溶于乙酸(20 mL)，加入Fe(1.19 g，21.2 mmol)。反应混合物在75℃氩气保护下搅拌2 h。用1 M NaOH调节pH至7，用乙酸乙酯稀释。有机层用饱和盐水(3×20 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并旋干。通过柱层析(PE∶EA=1∶1)纯化固体，得到所需的黑色固体产物120 mg，产率为26.8%。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ 7.31 (d，J=8.8 Hz，2H)，6.72 (d，J=1.8 Hz，1H)，6.69 (d，J=3.3 Hz，3H)，6.68 (s，1H)，6.56 (dd，J=8.0，1.9 Hz，1H)，6.46 (d，J=7.9 Hz，1H)，4.51 (d，J=51.5 Hz，4H)，2.90 (s，6H)；13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ 149.80，135.41，127.51，127.14，126.68，125.84，123.60，117.14，114.86，113.01，112.06，40.64. HRMS (ESI)calculated for C18H21N3：253.1579；found：m/z254.1664[M+H]+。

1.3 探针溶液制备

精密称取探针F-4固体3 mg，加入1.185 mL的DMSO溶解，制成浓度为10 mM的探针溶液，放入冰箱避光冷藏待用。使用前，加入DMSO梯度稀释，每次稀释10倍。

1.4 FA制备

配制10 mmol/L甲醛母液：用移液枪吸取9 991.9 μL的PBS缓冲液(10 mmol/L，pH=7.4)于15 mL的离心管中，再用10 μL的微量移液枪从37%的甲醛水溶液中吸取8.1 μL加于微量离心管中配成10 mL 溶液，并用微型涡旋混合仪振荡混匀，于冰箱中(4 ℃)密封保存。使用前用PBS溶液逐级稀释备用(每次稀释10倍)。

2 结果与分析

2.1 探针F-4表征及HPLC纯度分析

在探针合成过程中，所有中间体均经过核磁1H NMR、13C NMR或高分辨质谱的验证，确保所合成中间体的结构准确，且终产物通过HPLC纯化。

为了使探针检测FA达到最佳效果，需保证其纯度至少达到90%，纯化后探针F-4的HPLC分析结果见图3。通过对峰面积积分计算，其纯度超过95%，满足后续实验要求。

图3 F-4 HPLC分析图

2.2 探针F-4检测FA前后紫外变化

为保证实验检测结果的准确性，紫外及荧光实验皆配制3组平行样品，检测条件保持一致，最终结果取均值。

(1)精密量取之前配好的F-4溶液30 μL，加DMSO逐级稀释至10 μM的浓度，取300 μL至石英比色皿中，以DMSO溶液为参比溶液，使用紫外分光光度计测量其紫外最大吸收波长。

(2)精密量取30 μL浓度为1 mM的FA加至240 μL的PBS缓冲液中，再加入浓度为100 μM的探针F-4溶液30 μL，涡旋混匀，置于37 ℃恒温振荡箱中振摇30 min，以PBS溶液为参比溶液，使用紫外分光光度计测量其紫外最大吸收波长。结果见图4。

实验结果表明：探针F-4在未加入甲醛溶液时，紫外最大吸收峰位于380 nm处；探针F-4与甲醛溶液反应后，380 nm处吸收峰消失，在450 nm处出现一个新的吸收峰，由此说明，甲醛将探针F-4反应完全并生成一种新物质。

2.3 探针F-4检测FA前后荧光变化

本实验荧光检测条件为：窄缝10，10；电压850 V。

取上述紫外实验中配置好的探针F-4溶液，分别以所测得的紫外最大吸收波长380 nm和450 nm为激发波长，使用荧光光度计测量其发射波长。

取上述F-4+FA溶液，以所测得的紫外最大吸收波长450 nm为激发波长，使用荧光光度计测量其发射波长。结果见图5。

图5 F-4 检测FA前后荧光变化

实验结果表明：探针F-4在未加入甲醛溶液时，荧光强度较低，最大发射波长为510 nm；探针F-4与甲醛溶液反应后，荧光曲线在650 nm处出现了新的、明显的且很强的特征发射峰，说明探针F-4能够与甲醛反应生成具有荧光性质的物质，证实此探针可以有效的检测FA。

3 结 论

为了能够实现对甲醛更高效、更方便的检测，本研究基于PET荧光机制，设计合成了以邻苯二胺为识别基团的新型荧光探针F-4，并通过核磁与质谱进行了结构表征，HPLC分析其纯度>95%，紫外实验表明F-4在检测FA前后的紫外最大吸收波长变化较为明显，说明探针F-4被甲醛反应并生成了一种新的物质。而荧光实验显示，F-4与FA反应后光谱红移且荧光强度显著提高，证实了此探针可以有效的检测甲醛。