一种用于检测咖啡酸的荧光探针*

谢丽君，苏爱玲，陈佳琳，黄丽欣，刘炉英，刘青青

(广东第二师范学院化学系，广东 广州 510303)

碳量子点(CDs)是一类尺寸小于10 nm的新型发光纳米粒子，其主要由碳、氮、氧三种元素组成。碳量子点具有生物相容性、化学稳定性、毒性低等特性。因此，碳量子点被广泛应用在光催化[1-2]、能源器件[3]、细胞成像[4]等领域。

咖啡酸是一种羟基肉桂酸的有机化合物，其能抗菌抗病毒和调节免疫等。因此，咖啡酸在临床治疗上发挥不可或缺的作用。但也有相关报道表明，过量的咖啡酸积累在人体内会有一定的致癌风险[5]。在2017年，咖啡酸还被列为二类致癌物。因此，合理控制咖啡酸的摄入量和监测人体内咖啡酸含量是非常有意义的。但现存的一些方法或多或少存在着需要进行一定的预处理、分析成本较高、检测时间过长等缺点，故需要开发一种新型的经济有效且简便快捷的测试方法。本文选用无水柠檬酸和N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷利用裂解法合成碳量子点(CDs)。基于咖啡酸能使该碳量子点发生荧光猝灭的原理，设计和开发一种基于碳量子点的荧光探针用于定量检测咖啡酸。

1 实 验

1.1 试剂与仪器

无水柠檬酸和N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)，阿拉丁试剂公司；咖啡酸(AR)，麦克林生化科技有限公司；咖啡酸片，德州徳药有限公司。其它试剂均为分析纯试剂。实验用水均来来自超纯水机纯化的超纯水(18.2 MΩ·cm)，上海乐枫生物科技有限公司。

F97Pro荧光分光光度计，上海棱光技术有限公司；FEI talosf200s透射电镜，赛默飞世尔科技有限公司；Tensor27傅立叶变换红外光谱仪，德国布鲁克公司；稳态/瞬态荧光光谱仪FLS1000，美国爱丁堡；滨松量子效率测试系统，日本滨松光子学株式会社。

1.2 碳量子点的合成

在氮气氛围下，将10 mL的N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)放入100 mL三颈烧瓶中并开始升温。当三颈烧瓶内溶液达到240 ℃时，在剧烈搅拌的情况下将0.5 g的无水柠檬酸快速加入到三颈烧瓶中并保持1 min。最后，用石油醚充分洗涤3次得到最终产物，即可获得碳量子点[6]。将制得的有机硅烷化碳量子点用超纯水在棕色的容量瓶中配制成1 mg/mL的碳量子点储备液并将其放在4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 咖啡酸的测定

取2 mL的碳量子点储备液和2 mL的不同浓度的咖啡酸溶液，混合均匀并反应5 min。然后，测定混合溶液在激发波长为380 nm，激发和发射狭缝均为10 nm，增益为600 V时的荧光值并计算F0/F-1的值，其中F0为不存在咖啡酸时的荧光强度，F为存在咖啡酸时的荧光强度。

2 结果与讨论

2.1 碳量子点的表征

通过TEM、FTIR、UV-vis光谱和荧光光谱对CDs的显著特征进行分析和讨论。如图1a所示，CDs的透射电镜图显示合成的CDs呈现球形，平均粒径约为1.5nm，尺寸较为均一。如图1b所示，CDs红外谱图比AEAPMS的红外谱图多了一处在 1 652 cm-1的特征峰，该特征峰主要是由C=ONR振动引起的，这个典型的信号表明CDs表面成功钝化。为了深入了解CDs的光学特性，探究了CDs的UV-vis吸收光谱与荧光光谱。如图1c所示，合成得到的CDs在UV-Vis吸收光谱中显示出明显的特征吸收且集中在356 nm处，在荧光光谱中显示激发波长和发射波长分别是380 nm和463 nm。如图1d所示，在340～380 nm范围内激发时，CDs会在463 nm处显示出强烈的光致发光。随着激发波长的进一步增加，发射波长开始出现红移、光致发光强度降低和半峰全宽增宽的现象，这说明合成的CDs对激发波长具有依赖性。

图1 CDs的透射电镜图(a)；CDs和AEAPMS红外对比图(b)；CDs的UV-Vis吸收光谱、荧光发射谱和激发谱(c)；CDs在不同激发波长下的荧光光谱(d)

2.2 碳量子点的稳定性

为了更好的构建荧光探针，分析和讨论了CDs的稳定性。如图2a所示，CDs在紫外光下连续照射12 h后荧光强度变化幅度很小。如图2b所示，CDs处于较高的离子浓度下，其荧光强度变化幅度非常小。见图2c和图2d，在pH值为3～11的PBS和BR缓冲体系中，CDs的荧光强度均没有发生大幅度的变化。这写现象均表明CDs的荧光稳定性较强。通过滨松量子效率系统测试得到该碳量子点的量子产率为67%。

图2 激发时间对CDs荧光强度的影响(a)；n溶剂对CDs荧光强度的影响(b)；PBS体系中pH对CDs荧光强度的影响(c)；BR体系中pH对CDs荧光强度的影响(d)

2.3 条件优化

为了构建的荧光探针能更好的应用在检测咖啡酸当中，研究了分散溶剂对CDs荧光强度的影响以及反应时间对CDs-CA体系猝灭程度的影响。如图3a所示，CDs分散在超纯水中荧光强度是最大的。如图3b所示，加入咖啡酸溶液后，CDs的荧光开始猝灭，并在5 min内趋于平稳状态。因此，后续实验选择超纯水作为反应溶剂和反应时间选为5 min。

图3 分散溶剂对CDs荧光强度的影响(a)；反应时间对CDs-CA体系荧光猝灭程度的影响(b)

2.4 标准曲线

基于咖啡酸能使CDs发生荧光猝灭现象，构建一种用于检测咖啡酸的荧光探针。见图4a，在咖啡酸浓度为0.5～120 μM时，随着咖啡酸浓度的不断增加，CDs荧光强度不断下降。根据CDs的荧光猝灭强度和咖啡酸浓度的关系，绘制标准曲线。如图4b所示，标准曲线的校正方程为F0/F-1=0.007 1c+0.000 2。R2=0.999 36。方法的最低检出限为0.051 μM。与其他检测咖啡酸的方法相比，本研究方法有着更低的检出限或较宽的检测范围，详见表1。

表1 不同方法检测咖啡酸的比较

图4 咖啡酸浓度对CDs荧光强度的影响(a)和标准曲线(b)

2.5 选择性

为了验证CDs对咖啡酸具有选择性，将咖啡酸与一些常见阳离子(Na+、Mg2+、Ca2+)、糖类(葡萄糖、蔗糖)、氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、胱氨酸)进行比较。见图5，与其他物质相比，CDs在存在咖啡酸溶液时，荧光猝灭程度最高。这表明其他物质不能使荧光探针发生猝灭现象或者猝灭程度较小。

图5 不同物质对CDs的荧光猝灭效果相比

2.6 荧光猝灭机理的探究

为了探究荧光猝灭机理，分析CDs在存在和不存在咖啡酸情况下的UV-vis吸收光谱图。如图6a所示，CDs在356 nm处有吸收峰，CA在285～320 nm范围内有着吸收带。而当CDs加入CA后，出现了新的吸收峰。因此，推测是有基态复合物生成而导致荧光猝灭，该反应的猝灭机制可能是静态猝灭。为了进一步推断该反应的猝灭机制，故通过测定荧光寿命来判断猝灭机制。如图6b所示，τ0/τ≈1(τ0是CDs的荧光团的寿命，τ是引入猝灭剂(CA)后的荧光团的寿命)，因此，可以表明该反应的猝灭机制是静态猝灭。

图6 CDs、CA和CDs加入CA后得紫外可见-吸收光谱(a)；CDs和CDs加入CA后的荧光寿命曲线(b)

2.7 实际应用

为了验证构建的基于有机硅烷化碳量子点的荧光探针是否能进行实际应用，本研究将该荧光探针应用在检测市售咖啡酸片的咖啡酸含量当中。见表2，计算所得的回收率为99.66%～103.47%，RSD为2.12%～3.24%。

表2 基于CDs的荧光探针用于检测咖啡酸片中咖啡酸的结果(n=3)

3 结 论

本研究构建一种用于检测咖啡酸的碳量子点荧光探针，其合成方法简单、生物相容性好、荧光强度稳定且高。该荧光探针与已经报道的咖啡酸检测方法相比，其有着更低的检出限和更宽的检测范围。相信在以后更加深入的研究中，该荧光探针能广泛应用在医学检验等检测领域中。