基于微卫星标记探究5个虹鳟和金鳟养殖群体的遗传多样性

杨顺文,杨濯羽,苏子郡,焦文龙,卡 伟,史小宁

(1.甘肃省水产研究所,甘肃 兰州 730000;2.甘肃省黄河上游渔业资源环境野外科学观测研究站,甘肃 兰州 730030)

生物的遗传多样性是生物长期进化的产物,研究生物的遗传多样性具有重要意义[1]。对野生鱼类遗传多样性的研究不仅可以揭示物种的起源与进化历史,也能为遗传资源的保存、育种和遗传改良等工作提供理论依据[2]。国内外学者对鱼类养殖群体的遗传多样性分析有不少研究报道,包括鲤(Cyprinuscarpio)[3]、罗非鱼(Oreochromisniloticus)[4]和大口黑鲈(Micropterussalmoides)[5]等。虹鳟等鳟鱼自1959年引入我国,经过多年的发展,已具有一定的规模,开展虹鳟养殖群体遗传研究也有较为重要的理论和应用价值。

自20世纪80年代以来,简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)即微卫星(Microsatellites DNA)技术逐渐成为使用最多、最重要的分子标记方法之一。微卫星具有多态性高、稳定性好、呈共显性遗传且在基因组内分布广泛等特点[6],被应用于种群生物学、分子遗传学、生态学、系统学、生物多样性及保护研究、连锁作图、性状关联研究和比较基因组当中[7-9]。

虹鳟原产于美国加利福尼亚,1874年经人工驯化后在世界各地进行养殖[10],是经济价值较高的冷水性养殖鱼类之一。目前,中国已有20多个省市开展了虹鳟养殖,主要产区在西北的青海、甘肃、新疆以及西南地区的四川、云南等地。虹鳟肉质鲜嫩,营养丰富,适应性较强,适合高密度集约化养殖,已成为中国重要的淡水养殖鱼类品种之一[11]。目前主要养殖道氏虹鳟、甘肃金鳟和挪威虹鳟等品种,丰富了我国冷水性经济鱼类的种质资源库。国内外许多学者针对虹鳟多样性开展了大量研究[12-14],但主要以道氏虹鳟与金鳟的比较研究为主,针对多个虹鳟品系开展遗传多样性的研究不多。本文对道氏虹鳟、挪威虹鳟、波兰虹鳟、甘肃金鳟和丹麦金鳟5个群体的遗传结构进行微卫星标记分析,以期为我国目前主要养殖的虹鳟和金鳟种质提供遗传评估信息,为其遗传育种研究和实践提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所使用的5个虹鳟养殖群体样本于2019年采集于甘肃临夏鲑鳟鱼良种场。试验中剪取每条鱼的尾鳍约0.4～0.5 g,储存在无水乙醇中(若储存时间过长需更换乙醇),保存备用。采用酚-氯仿法提取每条鱼的基因组DNA[15]。分析使用的虹鳟和金鳟群体以及每个群体所分析的个体数量信息见表1。

表1 群体个体数量

1.2 引物选取及PCR扩增

依据赵莹莹等[10-12]的报道选取30对引物,由生物公司合成后检测其多态性,再从中筛选出多态性最高的8对引物,在每对微卫星的正向引物5′端,采用FAM或HEX荧光染料进行标记,引物信息见表2。

表2 微卫星位点的序列及引物信息

1.3 PCR反应体系及产物检测

PCR反应体系的总体积为15 μL,参考庞美霞等[11]实验方法,配置体系。PCR反应程序如下:94℃预变性5 min;94℃变性35 s,48℃～60℃退火35 s,72℃延伸40 s,共32个循环;72℃终延伸10 min。采用DNA测序仪对PCR产物进行测定[10]。

1.4 统计与分析

使用Gene Marker 2.2软件对片段大小进行统计。采用软件Pop Gene 32计算观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)以及Nei’s遗传距离等参数。运用Microsoft-toolkit插件获得多态信息含量(PIC)。使用MEGA 5.0软件对5个虹鳟群体的遗传距离进行聚类分析。使用Arle-quin 3.1软件计算群体间的分化系数(Fst)[11-15]。

2 结果与分析

2.1 各个微卫星位点多态性及群体遗传多样性分析

研究结果显示,8个微卫星标记在所有个体中一共获得111个等位基因。8个位点的等位基因数分布在8～18个之间,8个位点的平均等位基因数为13.875个,位点RT14与RT25的等位基因数最多,均为18个;位点RT16的等位基因数最少,为8个,见表3。有效等位基因数Ne在6.740～15.834之间,观测杂合度Ho与期望杂合度He分别在0.451～0.901和0.853～0.938之间。PIC是分析群体遗传多样性的重要研究内容,而本研究所选位点的PIC在0.838～0.933之间,说明它们均为高度多态性位点(PIC>0.5)。

表3 8个微卫星位点遗传参数

由表4可知,在所有鳟鱼群体中,DR的平均Na最高(13.88),DGR的平均Na最低(5)。各群体的平均He在0.599～0.832之间,平均Ho在0.605～0.788之间,平均PIC在0.532～0.808之间。其中,He和PIC最高的群体为DR,最低的群体为DGR;Ho最高的群体为DR,最低的群体为GR。在所有群体中,DR的Na、Ne、He、Ho和PIC值均较大,这表明DR的群体遗传多样性较高;而GR和DGR 2个群体各自的平均多样性参数都相对较小,表明相对于其他虹鳟群体,这2个金鳟群体的群体遗传多样性较低。

表4 5个鳟鱼群体的遗传多样性参数

2.2 群体间遗传分化分析

8个微卫星标记在5个鳟鱼群体的遗传分化分析结果如表5所示。5个鳟鱼群体的Fst值在0.118～0.313之间,群体两两间的Fst均差异显著(P<0.05),表明各群体间皆存在中等及以上程度的遗传分化。其中,GR和DGR之间Fst差异最大,为0.313;DR和PR之间Fst差异最小,为0.118。通过分析显示,群体内部的遗传变异为80.13%。这个结果说明群体间遗传分化明显,与所有群体均是人工选育这一事实相符。

表5 5个鳟鱼群体的遗传分化

2.3 群体间遗传距离及聚类关系

各个虹鳟群体间的遗传距离和相似系数如表6所示,遗传相似系数在0.197～0.405之间,遗传距离为0.905～1.627,可以看出道氏虹鳟和丹麦金鳟的遗传距离最大,其余各个群体间的遗传距离在0.905～1.627之间。以遗传距离为依据,对5个养殖虹鳟群体进行聚类分析,结果如图1所示,邻接树中共有3大分支,其中NR和PR聚为一支,DR和GR聚为一支,DGR单独为一支。

图1 5个鳟鱼群体的聚类分析

表6 虹鳟群体间的遗传距离(下)和遗传相似性(上)

3 讨论

养殖鱼类群体的遗传多样性问题一直都倍受关注。我国自1959年引进虹鳟以来,已开展人工养殖多年,由于引进的品种有限,加之存在大量近交繁殖的现象,已经严重影响了种群的遗传多样性,出现了种质退化的现象[16-18],该问题会阻碍虹鳟养殖产业的进一步发展。基因杂合度反应各群体在各个位点上的遗传变异,被认为是一个适合度量群体遗传变异的参数[19]。徐浩等[20]对渤海站的4个虹鳟养殖群体的研究表明,2011年挪威虹鳟和美国金鳟的样本等位基因数、有效等位基因数和多态性信息含量显著低于2005年样本(P<0.01)。张艳萍等[21]于2010年的研究显示,甘肃金鳟的平均期望杂合度为0.498,平均观测杂合度为0.430,低于本研究中甘肃金鳟的0.668和0.605;道氏虹鳟的平均期望杂合度为0.665,平均观测杂合度为0.601;杨濯羽等[22]的研究显示,22个道氏虹鳟平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.780和0.771,均低于本研究中道氏虹鳟的0.832和0.788。这可能是由3种原因导致:一是等位基因位点的统计方式不同。与传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显色相比,使用荧光标记STR分型技术检测到的等位基因数要比前者多。有研究显示,利用相同的8对微卫星标记对同一物种进行遗传多样性研究,使用测序仪分型检测技术[23]检测出的等位基因数为7～12,而使用传统聚丙烯酰胺凝胶电泳技术[25]检测出的等位基因数为2～6。二是微卫星标记的种类和具体位点不同可能会影响群体遗传多样性各指标的大小。三是为避免近亲繁殖而采取的人为干预措施可能使养殖的虹鳟群体的遗传多样性有所提高。

PIC是衡量微卫星位点变异程度高低的重要指标。一般认为,在某一群体中,当PIC>0.5时该位点表现为高度多态;当0.25

基因分化系数是表征群体间遗传分化的重要指标。Paaver[25]等采用10个高度多态性的微卫星标记分析了欧洲的12个虹鳟养殖群体的遗传多样性,研究结果表明呈中度分化。梁俊等[26]研究分析了欧洲鳗鲡和日本鳗鲡的遗传分化系数,研究结果大于0.25,认为群体间分化极大。本研究中5个鳟鱼群体间的Fst均大于0.05,这表明它们之间存在中等程度以上的遗传分化。

根据Nei氏遗传距离所绘制的5个养殖虹鳟群体的邻接树显示,NR和PR之间的遗传距离最小,而与DGR的遗传距离最大。整体上3种虹鳟之间较为接近,2种金鳟之间也较为接近,这个结果与徐浩等[20]的结果一致。聚类分析的结果可以反映亲缘关系的远近,本研究较好地反映了5个鳟鱼群体的亲缘关系。从聚类结果中发现,2种金鳟的遗传结构在几个群体中最近。金鳟为虹鳟的白化群体,丹麦金鳟与甘肃金鳟在最初开展选育时也是在虹鳟群体中选择其白化群体,最终成为金鳟品种[22]。在虹鳟的选育过程中,主要以速生、抗逆为选育指标,在育种过程中主要以生长性状为选育标准。而金鳟体色为黄色或金黄色,较虹鳟具有更好的观赏价值,所以在金鳟的选育过程中,体色成为了一个重要指标。因此,经过长期选育的金鳟虽然是由不同国家所培育的品种,遗传上交流的可能性极小,但较之其他虹鳟品系,2个金鳟品系遗传结构更为接近。

4 结论

通过对5个虹鳟群体进行微卫星遗传分析,发现甘肃临夏鲑鳟鱼良种场保存的鳟鱼养殖群体整体上仍具有较高的遗传多样性,各个群体间遗传结构与其他群体分化明显,具备进一步本地化选育的潜力。然而,2个金鳟群体遗传多样性明显低于其他虹鳟群体,在进行本地化选育或人工繁育时仍应注意避免繁殖亲本群体过小等问题,以保护金鳟群体的遗传多样性不再降低。