果洛地区传统发酵牦牛酸奶中乳酸菌的分离鉴定

吴海玥,闫忠心,任海佳,杨啟霞,郭娅慧

(1.青海大学畜牧兽医科学院,青海 西宁 810016;2.青海大学农牧学院,青海 西宁 810016)

乳酸菌是发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称[1],其主要的代谢物为乳酸,它可以将碳水化合物发酵成乳酸,是一类微生物的统称[2]。乳酸菌的分布比较广泛,在所有动植物及微生物中都能找到它,肉、奶及蔬菜等食品及其加工制品中也有乳酸菌存在[3]。传统发酵制备的酸奶不仅营养丰富,具备增强人体免疫力的功效,还可以调节肠道菌群平衡,缓解乳糖不耐受引起的腹胀、腹泻等症状,调节神经系统,缓解神经紧张,防止骨质疏松及有效地降低血液中的胆固醇含量等[4-9]。

青海省拥有丰富的牦牛奶源。牦牛乳的特性与高寒地区的自然环境及牧区牧民的生活息息相关[10],牦牛酸奶更是牧区的重要经济来源之一,其营养成分比普通牛奶高[11],当地的牧民世代沿用传统的自然发酵方法,所制作的酸奶中含有性能优良的乳酸菌群,风味独特,口感鲜美,组织形态完整,是青藏高原地区的人们广泛食用的一种绿色有机酸奶[13]。本实验采集传统发酵牦牛酸奶,对其中的乳酸菌种进行分离纯化及鉴定,为我省牦牛乳资源的加工及可持续发展提供数据基础[15]。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验样品 实验样品为牧区牧民家庭的传统发酵牦牛酸奶,采自青海省果洛藏族自治州班玛县2份、甘德县2份、玛沁县2份和玛多县2份。

1.1.2主要试剂 MRS培养基,购自杭州百思生物技术有限公司;草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、番红染色液、香柏油、甘油,均购自上海尚宝生物科技有限公司;95%乙醇,购自天津市富宇精细化工有限公司;生化鉴定试剂盒,购自上海沪峥生物科技有限公司。

1.1.3主要仪器设备 电子天秤(YP402N),购自广东香山衡叶集团股份有限公司;电磁炉(C22-RT22E01),购自广东美的生活电器制造有限公司;高压蒸汽灭菌锅(LDZX-75KBS),购自上海申安医疗器械厂;CO2恒温培养箱(HF240),购自浙江纳德科学仪器有限公司;磁力搅拌器(78-1),金坛市大地自动化仪器厂;显微镜(OLYMPUS-IX71),购自上海普赫光电科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1样品的采集 采集青海省果洛藏族自治州4县传统发酵的牦牛酸奶样品,分别存于采样管中,标注采集地名、编号及来源等信息,在0～4℃冷藏条件下带回实验室。

1.2.2培养基制备

1.2.2.1MRS琼脂/肉汤培养基的制备 分别称取MRS琼脂/肉汤培养基置于烧杯中,加入对应量的蒸馏水进行水浴加热,并用玻璃棒搅拌至溶解。

1.2.2.2灭菌 先将溶解好的培养液和培养皿等实验用品置于高压蒸汽灭菌锅中,在121℃条件下灭菌15～20 min,然后置于超净工作台上用紫外线照射30 min,灭菌、通风15 min。

1.2.2.3固体培养基制备在灭菌后的培养皿中加入约15 mL 的灭菌MRS琼脂液,其冷却凝固后即成培养基。

1.2.3菌液的配置 取10 mL样品加入装有90 mL蒸馏水的无菌均质杯内,8 000～10 000 r/min磁力搅拌器均质1～2 min。取1 mL上述菌悬液置于9 mL的无菌水中,将其振荡混合均匀形成10-1的稀释液,并按照10倍系列梯度稀释,依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度的稀释菌悬液。

1.2.4菌株分离纯化 用无菌吸管分别吸取10-4、10-5和10-6的稀释菌悬液各0.20 mL,分别对应接种于3个MRS琼脂培养基中。将菌液均匀涂布于平板上,每个稀释度做2个平行,静置20 min后,将其倒置放在37℃的 CO2恒温培养箱中培养48 h。待培养结束后取出培养基观察菌落,用接种环挑取有透明环的,不同形状、大小及颜色的单个菌落,分区划线接种在MRS琼脂培养基上,于37℃的CO2恒温培养箱中继续培养48 h,进一步纯化菌株。待平板上的菌落形成后,取出培养平板,选择菌落分布较好的平板进行观察,挑选形态不同的菌落在MRS琼脂培养基上继续进行分离纯化,直至培养基表面生长的菌落一致。对菌株进行编号,并记录颜色、形态、大小、表面突起程度等特征。

1.2.5菌落形态学鉴定 从分离纯化的菌株中选择表面光滑有光泽、边缘整齐、有凸起的白色菌落,进行革兰氏染色并镜检,染色结果呈蓝紫色的为革兰氏阳性菌[16,17]。通过溶菌环、菌落的形状及大小、革兰氏染色情况等特征,初步判定为乳酸菌。

1.2.6乳酸菌生化鉴定 根据菌落形态及革兰氏染色结果,参照《伯杰细菌鉴定手册》[18,19]对菌株进行生理生化试验,根据GB4789.35-2023[20]的乳酸菌检验标准,利用生化鉴定试剂盒对从中分离到的乳酸菌进行菌种的鉴定。

1.2.7MRS肉汤培养基扩增培养 将灭菌冷却后的MRS肉汤培养基分装到试管中,每个试管分装约5 mL,挑选反复纯化后的单一菌落至试管中,放置在37℃的CO2恒温培养箱中培养48 h。

1.2.8菌株保藏 在冻存管中加入300 μL甘油和700 μL菌液,将其混合均匀后在冻存盒中进行标注分装,于-80℃条件下冻存。

2 实验结果

2.1 分离菌株鉴定结果

2.1.1分离菌株菌落形态特征 青海果洛地区4县的8份牦牛酸奶样品中共分离了16株菌株,在培养基上菌落形态呈圆形,颜色为白色或乳白色,中部凸起或扁平,表面有的光滑有的粗糙,边缘有的整齐有的不齐,与乳酸菌菌落形态基本一致。(见图1～图4、表1)。

表1 果洛州4县牦牛酸奶菌株菌落的形态特征

图1 班玛县牦牛酸奶菌株菌落形态

图2 甘德县牦牛酸奶菌株菌落形态

图3 玛沁县牦牛酸奶菌株菌落形态

图4 玛多县牦牛酸奶菌株菌落形态

2.1.2革兰氏染色镜检结果 对分离株进行染色、镜检,结果显示,分离得到的16株菌全部为革兰氏阳性菌,其中8株为链球菌,8株为杆菌(如图5-8、表2)。结合对其生长特征及形态的显微镜中观察,初步判定分离的16株菌为乳酸菌。

表2 菌株镜检形状

图6 甘德县酸奶菌株镜检结果

图7 玛沁县酸奶菌株镜检结果

图8 玛多县酸奶菌株镜检结果

2.1.3生化鉴定结果 对分离筛选出的8株杆状乳酸菌和8株链球状乳酸菌进行进一步鉴定。鉴定结果见表3、表4。结果表明,从班玛县所采集样品分离的4株菌中,1株为嗜热链球菌、1株为罗伊氏乳酸杆菌、2株为干酪乳酸杆菌;从玛多县所采集样品分离的4株菌中,1株为德氏乳酸杆菌、1株为罗伊氏乳酸杆菌、2株为嗜热链球菌;从甘德县所采集样品分离的4株菌中,2株为嗜热链球菌、2株为德氏乳酸杆菌;从玛沁县所采集样品分离的4株菌中,3株为嗜热链球菌、1株为嗜酸乳杆菌。

表3 乳杆菌生化鉴定结果

表4 链球菌生化鉴定结果

3 结论与讨论

本实验从果洛州班玛县、甘德县、玛沁县和玛多县4个地区的8份牦牛酸奶样品中共分离出16株乳酸菌,其中3株为德式乳酸杆菌、2株为干酪乳酸杆菌、2株为罗伊氏乳杆菌、1株为嗜酸乳杆菌、8株为嗜热链球菌。4个不同地区样品的乳酸菌中,均有嗜热链球菌;甘德县和玛多县的样品中有德式乳酸杆菌,班玛县和玛多县的样品中有罗伊氏乳酸杆菌,班玛县的样品中有干酪乳杆菌,玛沁县的样品中有嗜酸乳杆。从上述结果中可看出,不同地区的酸奶中乳酸菌的种类有所不同,这可能与青海省不同地区地理环境的差异较大有关,地区海拔分布以及氧气含量的不同,使得微生物菌群的生长环境出现差异。此外,同一地区样品中的乳酸菌种也存在差异性,这可能是由制作原料及工艺的不同所造成的,还有待于进一步的研究。