河南省猪伪狂犬病病毒感染情况调查及gE基因遗传变异分析

王华俊,王东方,闫若潜,刘光辉,房大学,郭洛生

(河南省动物疫病预防控制中心/河南省重大动物疫病监测预警及防控重点实验室,河南郑州 450008)

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的可导致猪、牛、羊等多种家畜和多种野生动物发病甚至死亡的一种传染病[1-2],其中猪为PRV的自然宿主,也是唯一的病毒贮存宿主[3]。猪感染PRV主要引起呼吸系统疾病、脑脊髓炎、母猪生殖衰竭和小猪生长迟缓等[4-5],病死率为50%～80%,给全球养猪业带来严重损失。据报道,PRV也可感染人,引起脑炎及严重的神经症状,直接危害人类健康[6-7]。

PRV是疱疹病毒科、阿尔法疱疹病毒亚科、水痘病毒属的成员。PRV是一种双链DNA病毒,编码70多种蛋白质,包括病毒衣壳、外壳和囊膜[8],其中gB、gD和gC诱导细胞和体液免疫反应[9],gE为其主要毒力基因[10],通常用于监测PRV的遗传进化分析[11-12]。

我国非常重视猪伪狂犬病的防控,20世纪90年代,引进了PRV Bartha-K61 gE缺失疫苗并在猪场广泛使用,并取得了良好的防控和净化效果。然而,2011年以来,国内出现了毒力较强的PRV变异株,引起免疫猪场继续暴发猪伪狂犬病[13],部分阴性猪场转阳,基于Bartha-K61株的PRV商品化疫苗对新出现的PRV变异株的感染不能提供完全保护[14-15],部分猪场发生猪伪狂犬疫情,造成了较大经济损失。许多国家已经根除了猪伪狂犬病,这与猪伪狂犬病病毒gE缺失疫苗及配套的鉴别试剂盒的临床应用密不可分,目前国内猪伪狂犬疫苗主要为gE缺失疫苗,通过检测猪血清gE抗体,能够鉴别PRV野毒感染。

河南省位于我国中部,拥有养猪场数众多,规模数量庞大,年出栏量名列前茅,为了解河南省PR流行情况,本研究对河南省猪群开展了血清学和病原学调查,并对PRV gE基因进行遗传变异分析,研究PRV毒力基因变异情况,以期为河南省PR疫苗株的筛选、净化和综合防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 猪血清和病料 2020年11月至2021年10月,采集河南省18个地市的253个不同规模场点、不同生长阶段的猪血液,所有采血猪免疫猪伪狂犬病毒gE缺失疫苗或未免疫猪伪狂犬疫苗,每个场点采集血液样品20～60份不等,挑选其中的60个不同规模的场点采集不同阶段猪血液进行不同阶段猪群gE抗体阳性率分析,每个场点分别采集种公猪血液5份、经产母猪血液10份、后备母猪血液4份、保育猪血液6份、育肥猪血液10份。猪前腔静脉采血,室温静置4～8 h,2 000 r/min离心5 min,分离血清,每份血清样品至少1 mL,共采集9 540份样品,置-20 ℃保存备用;病料来源于河南省不同区域的猪场、屠宰场和无害化处理厂病死猪淋巴结、脾脏和流产胎儿脑组织,采集新鲜病料,取各个组织适量剪碎,装入2 mL离心管中,组织匀浆仪匀浆5 min,共采集1 649份,置-20 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 PRV gE抗体检测试剂盒,Idexx公司产品;核酸提取试剂盒,西安天隆生物科技有限公司产品;PRV gE荧光检测试剂盒,世纪元亨公司产品;GC buffer、dNTPs、ExTaqDNA聚合酶、DNA标准DL 2 000、pGEM-T克隆载体、大肠埃希氏菌JM109感受态细胞、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒、Mini BEST质粒提取试剂盒,宝生物工程(大连)有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 全自动核酸提取仪,西安天隆生物科技有限公司产品,Thermo酶标仪、台式冷冻高速离心机、小型摇床,美国赛默飞公司产品;7500荧光PCR仪,ABI公司产品;Tprofessional型PCR扩增仪,Ependorf公司产品;405TS微孔板全自动洗板机,美国伯腾仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 血清样品PRV gE抗体检测 血清样品的检测均在河南省动物疫病预防控制中心血清学实验室进行,操作方法严格按照Idexx公司的PRV gE抗体检测试剂盒说明书进行。通过计算样品OD值与阴性对照的OD值的比值(S/N值),判定PRV gE血清抗体阴阳性,结果判定标准:当S/N≤0.6时,判定为阳性;S/N>0.7,判定为阴性;0.6

1.2.2 PRV gE抗体检测数据统计分析 将检测的PRV gE抗体数据录入Excel表格中,按照不同场群、不同生长阶段猪群和不同季节猪血清gE抗体阳性率进行统计分析。

1.2.3 组织样品中PRV病毒核酸检测 将1.1.1研磨组织样品放在4 ℃冰箱中解冻,离心后取上清,采用核酸提取仪器以磁珠法提取病毒核酸,使用世纪元亨公司PRV gE荧光检测试剂盒进行病毒核酸检测,操作方法和结果判定严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 部分猪场PRV gE基因扩增及序列测定 将来自河南省不同区域的部分PRV gE核酸阳性组织采用磁珠法提取病毒核酸,以闫若潜等[16]报道方法扩增PRV gE全长基因序列,PCR产物置于10 g/L的琼脂糖凝胶上电泳分析,回收电泳胶目的条带,并使用胶回收纯化试剂盒进行核酸纯化,将目的片段连接上pGEM-T克隆载体,转化到大肠埃希氏菌JM109感受态细胞后筛选阳性菌、摇菌扩增,提取质粒,将质粒送至宝生物工程(大连)有限公司进行PRV gE基因序列测定。

1.2.5 PRV gE基因遗传进化分析 利用DNA Star和Mega 7.0软件对本次测定的PRV gE基因序列进行分子遗传变异分析,并与GenBank中近年来登录的国内外PRV毒株的gE核苷酸序列进行比对,分析河南流行毒株序列特征。

2 结果

2.1 PRV gE血清抗体检测总体情况

本次调查分别监测了河南省种猪场、商品代养殖场、散养户和屠宰场共253个场点,其中137个场点检出PRV gE阳性血清样品,场群阳性率为54.15%,共检测PRV gE血清样品9 540份,其中阳性血清样品2 483份,平均个体阳性为26.03%。

2.2 不同场群猪血清PRV gE抗体阳性率

将检测结果按照种畜场、商品代场、散养户和屠宰场等场群进行血清学阳性率统计,结果显示,商品代养殖场场群阳性率和平均个体阳性率均最高,分别为59.03%、33.41%,散养户的场群阳性率次之,为58.33%,屠宰场的平均个体阳性率为27.25%,比散养户高1.08%,种畜场的场群阳性率和平均个体阳性率均最低,分别为42.22%和11.62%,不同场群猪血清PRV gE抗体阳性率详见表1。

表1 不同场群猪血清PRV gE抗体阳性率

2.3 不同生长阶段猪血清PRV gE抗体阳性率

选取其中的60个场点对不同生长阶段猪血清PRV gE阳性率进行检测,并统计分析。5个不同生长阶段的猪群中,保育猪的个体阳性率最高,为44.44%,其次是育肥猪,为32.50%,种猪群的个体阳性率低于15.50%,不同阶段猪血清PRV gE抗体阳性率详见表2。

表2 不同生长阶段猪血清PRV gE抗体阳性率

2.4 不同季节猪血清PRV gE抗体阳性率

对检测结果按季节进行统计,结果显示,不同季节的猪血清PRV gE抗体阳性率介于17.48%～29.79%之间,其中冬季的个体阳性率最高,为29.79%,夏季的最低,为17.48%,差异显著(P<0.05),不同季节猪血清PRV gE抗体阳性率见表3。

表3 不同季节猪血清PRV gE抗体阳性率

2.5 组织样品中PRV核酸检测

2020年11月至2021年10月从河南省不同区域的不同猪场、屠宰场和无害化处理厂共采集组织样品1 649份,磁珠法提取病毒核酸,使用世纪元亨公司PRV gE荧光检测试剂盒进行猪伪狂犬病病毒核酸检测,检出病毒核酸阳性样品54份,平均个体阳性率为3.27%。

2.6 PRV gE基因扩增及序列测定

从荧光PCR检出的核酸阳性的病料中选择来自豫东、豫西、豫南和豫北等不同区域的部分阳性病料,进行PRV gE全基因的扩增,扩增产物经过10 g/L的琼脂糖凝胶电泳,在1 700 bp处出现目的条带,与产物预期大小相符合,为阳性,对照组为阴性。采用电泳凝胶产物回收试剂盒进行产物回收,共获取4份PRV gE基因产物。将每1份产物连接上克隆载体,转化、筛选、鉴定,阳性菌液提取质粒后送宝生物工程(大连)有限公司进行PRV gE序列测定。

2.7 PRV gE基因遗传进化分析

本研究中获得的4株PRV gE基因序列之间核苷酸同源性为99.5%～99.9%;与国外欧美经典株Becker、Kaplan毒株的核苷酸同源性为97.3%～97.8%;与国内经典株Ea、Fa、SC等的核苷酸同源性为99.2%～99.5%;与国内流行变异毒株JS-2012株核苷酸同源性为99.6%～99.9%。基于PRV gE基因的系统进化树分析结果显示,30个国内外经典毒株、变异毒株gE基因序列被分为2个基因群,欧美毒株为GenotypeⅠ群,中国毒株为GenotypeⅡ群,中国毒株又可分为2个亚群,2011年之前的为经典株亚群,之后的为流行变异株亚群,本研究测定的4个gE基因序列同属于GenotypeⅡ群,属于相同分支,亲缘关系与流行变异株亚群更较近,均属于国内流行变异株,较稳定,与国外PRV经典毒株不属于同一进化树分支(图1)。结果进一步表明,我国在2011年后出现了PRV变异株,且从豫东、豫西、豫南和豫北检测到gE基因序列同为国内流行的变异株,同源性较高,这与我国免疫了经典毒株疫苗的猪场仍然暴发猪伪狂犬病相吻合。

图1 PRV gE基因遗传进化树

3 讨论

猪伪狂犬病是危害全球养猪业的重要传染病,我国猪场感染较为严重,四川、山东等猪场感染率均在20%以上,给我国养猪产业造成了较大的经济损失[17]。我国非常重视猪伪狂犬病的防控,普遍使用PRV基因缺失疫苗免疫,该疫苗为PR防控发挥了重要作用,同时为鉴别疫苗株与野毒猪感染提供可能[18-19]。目前商品化的PRV基因缺失疫苗有多种,单基因缺失、多基因缺失及部分毒力基因缺失等,但是所有的基因缺失疫苗都缺失了gE基因或大部分的gE基因,免疫了该类疫苗的猪场,gE抗体为阴性,只有当猪感染了野毒后才产生gE抗体,因此,通过检测gE抗体,可以鉴别野毒株感染动物和免疫动物。本研究采集的血清样品,均为免疫基因缺失疫苗或未免疫猪伪狂犬病疫苗,通过对gE抗体检测,准确判定猪场野毒感染情况。

本研究共监测河南省种猪场、商品代养殖场、散养户和屠宰场共计253场次,其中137场次检出PRV gE阳性血清样品,平均场群阳性率为54.15%,共检测PRV gE血清样品9 540份,其中阳性血清样品2 483份,平均个体阳性为26.03%,共检测组织样品1 649份,检出54份阳性样品,平均个体阳性率为3.27%,结果表明河南省猪伪狂犬病病毒感染较为严重。当前,我国动物疫病防控正从有效控制向净化消灭转型,猪伪狂犬病是国家首先提出并重点净化的动物疫病,我省积极响应并推动种猪场等大型规模场的净化工作,取得了较好成效,但形势依然严峻,应该引起有关政府部门和养殖场/户的重视。

从河南省不同场群猪血清PRV gE抗体阳性率来看,种畜场的gE抗体场群阳性率和个体阳性率均最低,商品代场阳性率最高,原因可能与我省农业农村部门不断推进种猪场疫病净化有关,通过不断“检测-淘汰阳性-再检测-再淘汰”循环模式进行,使我省种猪场伪狂犬病得到净化,另外,从猪场建设、生物安全措施、免疫程序及管理等方面比较,种猪场生物安全级别较高,更有利于动物疫病的净化和防控。2020年11月至2020年10月,4个季度PRV gE抗体阳性率均在17%以上,其中冬季抗体阳性率最高,达到了29.79%,表明猪伪狂犬病一年四季都可以感染,但以冬季多发频发,与报道的结果相一致[20]。冬季多发可能的原因是气温低有利于病毒存活,猪舍通风不良,有毒有害气体聚集,保暖措施较差,猪免疫力低,易发生传染病。

对猪伪狂犬病病毒阳性病料中gE基因的测序分析[21-22],河南省2019-2020年流行毒株与国内2012年以来流行的猪伪狂犬病病毒遗传距离相对较近,与国内外2011年之前的流行毒株相对较远,与本实验室近年来测定的序列核苷酸同源性较高。据报道,PRV经典毒株与变异株比对,变异株gE基因的特征性变异是在第48和492位均有1个天冬氨酸的插入,尤其是第492位天冬氨酸的插入,这可作为PRV变异株的分子特征之一[23-24]。对本研究测定的4株流行毒株的gE基因与经典毒株进行比对分析,发现在496位均有1个天冬氨酸插入,属于变异毒株,表明河南省流行的猪伪狂犬病主要由变异毒株引起,这可能是2012年以来在免疫了经典疫苗株的猪场仍不断暴发猪伪狂犬病的重要原因。

本研究通过对河南省不同区域、不同场点的不同阶段猪血清及组织样品进行检测,并对流行毒株的gE基因测序比对分析,初步了解了河南省PRV在猪群中的流行率、分布情况及流行毒株的遗传变异情况,为河南省PR的疫苗毒株筛选、净化等防控措施的制定提供了参考依据。