藏野驴皮肤成纤维细胞分离培养及生物学特性分析

姜红军,杜晓霞,索佳佳,王文超,王 睿,杨万郊,王云洲,姜八一,郑艳玲*

(1.山东畜牧兽医职业学院,山东潍坊 261061;2.昌邑市畜牧业发展中心,山东潍坊 261300)

藏野驴(Equuskiang)是青藏高原特有的奇蹄目动物,属于马科、驴属,是我国一级保护动物,主要分布于我国的西藏、青海、新疆、甘肃、四川等地,在印度、尼泊尔和巴基斯坦等国家的部分地区也有分布[1-4]。20世纪由于狩猎等因素的影响,导致藏野驴野外种群数量急剧下降,20世纪80年代被列为“濒危”物种。近年来随着国家对动物遗传资源多样性保护工作的不断加强,藏野驴得到了较为有效的保护,其种群数量明显回升,已由濒危物种转变为近危物种。但藏野驴的物种保护工作仍然极其重要。保种是动物物种保护工作的核心,针对动物保种,随着生物技术的发展,人们逐渐探索出了以群体遗传学为基础的活体保种方法和以分子遗传学为基础的生物技术辅助保种方法。动物体细胞携带动物完整的遗传信息[5],体细胞保种是现代生物学保种的重要组成部分,目前在国内已建立了大熊猫、黑麂、麋鹿等珍稀动物皮肤成纤维细胞系,并对其进行了细胞生物学特性和遗传资源保护研究[6-8]。藏野驴体细胞保种对于藏野驴物种保护极其重要,目前国内还未见关于藏野驴体细胞分离培养研究的相关报道,本研究关于藏野驴成纤维细胞分离培养方法的建立,将为深入研究藏野驴适应高原生境的分子生物学和生理学机制提供条件,同时为今后藏野驴遗传资源信息的保存和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物组织 藏野驴耳缘组织,取自青海省海北州祁连县1头7岁龄雄性藏野驴。

1.1.2 主要试剂 盐酸甲苯噻嗪(100 mg/mL),Bioveta公司产品;高糖DMEM(MA0212-Apr-09G6),Meilunbio公司产品;胎牛血清(S3709694),Invigentech公司产品;胰蛋白酶(MA0233-May-17G1),Meilunbio公司产品;抗菌药物(20201203),北京索莱宝公司产品;胎牛血清(S3709694),Invigentech公司产品;凋亡试剂盒(A2901360),YESEN公司产品。

1.1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱(MCO-170AICUVDL-PC),日本PHcbi公司产品;倒置荧光显微镜(Ti2-A),日本Nikon公司产品;流式细胞仪(CytoFLEX LX),美国Beckman公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集和处理 采用吹管麻醉法对体重250 kg的藏野驴注射盐酸甲苯噻嗪(100 mg/mL),进行麻醉,每次注射2 mL,共注射3次,注射量为2.4 mg/kg体重,注射后待藏野驴行动能力减弱时,人工用保定绳将藏野驴放倒,耳缘皮肤剃毛、消毒后,用无菌手术剪刀剪取无大血管处的耳缘组织,迅速放入盛有含双抗的PBS液中,冲洗3遍,然后将耳缘组织放入含双抗的生理盐水中8 h内带回实验室备用。

1.2.2 成纤维细胞的分离和培养 将新鲜采集的耳缘皮肤组织迅速放入75%的乙醇中浸泡5 s,在超净工作台中剔除软骨组织,取下皮肤,用加入双抗的无菌PBS冲洗3次,用无菌剪刀将组织剪成1 mm3左右大小的组织块,将其贴于60 mm培养皿,在组织块上滴加少量的细胞培养液,倒置放于体积分数为5%CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养4 h,使组织充分贴壁,然后取出培养皿,在皿底轻轻滴入细胞培养液,继续培养24 h后取出培养皿,在显微镜下观察,发现有细胞从组织块周围迁出,培养3～4 d后有大量细胞从组织块中迁出,培养5～6 d后细胞已铺满皿底80%以上,此时,将皿中的组织块弃去。由于迁出的成纤维细胞中混有上皮细胞,而用胰蛋白酶消化这两种细胞,细胞脱壁的时间不同,所以可以用差速消化的方法分离两种细胞。在本研究中,用胰蛋白酶消化混合细胞2 min后,用细胞培养液中和,吹打混匀后,用移液枪将其吸入4 mL离心管中(培养皿底未消化起来的圆形贴壁细胞即为上皮细胞,将其弃去),1 000 r/min离心5 min后,弃去上清,用细胞培养液重悬离心管底部细胞团块,将其接种在60 mm细胞培养皿中,用含150 mL/L胎牛血清的高糖DMEM培养基对细胞进行培养。

1.2.3 藏野驴成纤维细胞的免疫荧光鉴定 取第2、4、6、8代藏野驴成纤维细胞用40 mg/mL多聚甲醛室温固定15 min,将固定好的细胞用PBS洗涤3次。30% H2O21份+蒸馏水10份混合,室温10 min以灭活内源酶,蒸馏水洗3次,每次3 min。滴加正常山羊血清封闭液,烘箱37 ℃孵育35 min。孵育一抗,加入浓度为1∶500,将切片置于湿盒中放入4 ℃冰箱过夜。复苏,次日将切片置于37 ℃烘箱中复温40 min,PBS液冲洗3次,每次3 min。滴加二抗,放置于湿盒内,避免干片,37 ℃孵育1 h,然后用PBS洗3次,每次3 min。滴加DAPI将切片置于湿盒放在烤箱中,温度为37 ℃,10 min,然后用PBS洗4次,每次2 min。滴加抗荧光淬灭剂封片,避光保存,短时间内拍照。

1.2.4 细胞生长曲线的绘制 取第4代对数生长期的细胞, 2.5 mg/mL胰酶消化,血球计数板计数,加入到24孔板,1×106个/孔。设7个时间点,每个时间点设3个孔,正常培养,体积分数为5% CO2条件下37 ℃孵育24 h。分别于接种后1、2、3、4、5、6、7 d,分别取3个孔收集细胞进行计数并做记录。

1.2.5 细胞周期测定 取对数生长期的细胞, 2.5 mg/mL胰酶消化,血球计数板计数,加入到6孔板,5×106个/孔。正常培养48 h,体积分数为5% CO2的条件下37 ℃孵育24 h。收集细胞,1 500 r/min离心5 min收集细胞。用PBS洗涤细胞1次,1 500 r/min离心5 min,去除上清,加1 mL DNA 染色液和10 μL 渗透液,涡旋混匀,室温避光孵育30 min。上机检测,激发波长为488 nm。

1.2.6 细胞凋亡测定 取对数生长期的细胞,2.5 mg/mL胰酶消化,血球计数板计数,加入到6孔板,5×106个/孔,37 ℃培养48 h。将培养液和细胞都收集到15 mL离心管中,1 500 r/min离心5 min,收集细胞。用PBS洗涤细胞1次,1 500 r/min离心5 min,去除上清,收集细胞。细胞沉淀中加入5 μL PI和5 μL LA-V染色液混匀,4 ℃避光孵育10～15 min,上机检测,激发波长为488 nm和535 nm。

2 结果

2.1 藏野驴成纤维细胞的形态学观察

组织块培养3～4 d后便可见大量上皮样细胞与成纤维样细胞混杂生长,7 d后便可铺满皿底。经2～3次传代,获得较纯的成纤维细胞。细胞贴壁后大致呈梭形或不规则形状,细胞核位于中央,生长时呈放射状、漩涡状走向。原代细胞及传代细胞见图1和图2。

图1 原代藏野驴耳成纤维细胞(100×)

A.第2代;B.第4代;C.第6代;D.第8代

2.2 藏野驴成纤维细胞的免疫荧光鉴定

用FSP-1抗体标记获得的细胞,在不同代数的细胞中FSP-1出现稳定表达,可确定所得细胞为成纤维细胞,结果如图3所示。

A1、B1、C1、D1为FSP-1染色结果; A2、B2、C2、D2为Hoechst333258核染色结果; A3、B3、C3、D3为细胞核染色和FSP-1染色的复合图

2.3 细胞生长曲线检测结果

第4代藏野驴成纤维细胞在接种后2 d内细胞数量出现减少情况,2 d以后细胞生长速度开始进入指数生长期,至第5天时细胞生长速度达到平台期,细胞数量保持在一定的范围内,不再出现大幅度的增加或减少情况。藏野驴成纤维细胞生长曲线呈“S”形,细胞生长状态良好,结果如图4所示。

图4 藏野驴耳部皮肤成纤维细胞生长曲线

2.4 细胞周期测定结果

通过对不同代数的细胞进行细胞周期检测发现,第2代处于G0-G1期细胞占48%左右,S期细胞占14%左右,G2-M期细胞占35%左右,第8代处于G0-G1期细胞占47%左右,S期细胞占14%左右,G2-M期细胞占36%左右,细胞整体处于稳定分裂状态,结果如图5所示。

A.第2代;B.第4代;C.第6代;D.第8代

2.5 细胞凋亡检测结果

通过对不同代数的细胞进行细胞凋亡检测,发现第2代细胞早期凋亡细胞占2.25%。晚期凋亡的细胞占5.55%,随着细胞代数的增加,至第8代早期凋亡细胞占4.95%,晚期凋亡细胞数占1.93%,细胞整体凋亡率小于10%,细胞处于稳定生长状态,结果如图6所示。

A.第2代;B.第4代;C.第6代;D.第8代

3 讨论

藏野驴是国家一级保护动物,是野驴中体型最大的一种,由于生活在高原地区,对寒冷、日晒和风雪均具有极强的耐受力,具有重要的研究价值。藏野驴试验材料不易获得,因此,国内外对藏野驴的研究不多,近几年,国内外对藏野驴研究的文献在宏观方向,主要涉及藏野驴的生存环境、种群分布以及数量等方面[1,9-10];在微观方面主要是涉及藏野驴肠道微生物多态性的研究[11-14],在细胞水平上对藏野驴的研究尚未见报道。藏野驴体细胞的分离培养对于藏野驴的保种及在细胞水平、分子水平对藏野驴这一特有物种进行深入研究具有非常重要的意义。

动物活体耳部皮肤组织采样取材方便,而且不影响动物健康,是最为理想的取材方法,很多野生动物体细胞都是通过耳部皮肤取样分离培养得到的[15-18]。藏野驴野性极强,神经质,人很难靠近对其进行保定,因此,采样前需对其进行吹管麻醉。由于马属动物对于麻醉药物相对不敏感,而使用盐酸甲苯噻嗪对藏野驴进行麻醉的有效剂量无文献参考,因此,在麻醉过程中采用少量多次注射的方法,以避免麻醉剂过量导致藏野驴受到伤害的事件发生,通过试验最终得到盐酸甲苯噻嗪对藏野驴的有效剂量为2.4 mg/kg,为藏野驴麻醉保定提供了重要参考。

成纤维细胞是广泛分布在动物组织内的体细胞,分离方便。很多研究采用组织块培养消化后再利用差速贴壁纯化的方法获得细胞形态良好的成纤维细胞,本研究也采用此方法分离藏野驴成纤维细胞。FSP-1是成纤维细胞的标志性蛋白之一,本研究用FSP-1抗体进行免疫荧光试验发现,分离的细胞均发红色荧光,结合细胞形态学观察,证明分离的细胞是成纤维细胞。从细胞生长曲线看出,获得的藏野驴耳皮肤成纤维细胞在接种后1～3 d,细胞生长缓慢,可能是胰蛋白酶消化过程对细胞造成了破坏,细胞需要一定时间进行自我修复,之后细胞进入对数生长期,随着细胞密度的增加,细胞之间接触抑制使增殖速度下降,细胞进入平台期,整个细胞生长阶段符合正常的“S”型生长曲线,另外,细胞周期试验及细胞凋亡试验结果显示,分离的细胞培养至第8代仍然具有很强的增殖能力。因此,本研究成功建立了藏野驴成体成纤维细胞的分离培养方法,同时,揭示了藏野驴成纤维细胞的基本生物学特性,对深入研究藏野驴适应高原生境的分子生物学和生理学机制提供了很好的条件,为今后进一步研究藏野驴体细胞的利用及遗传资源信息的保存奠定了基础。