猫传染性腹膜炎病毒的检测及ORF 7ab、N和S基因遗传进化分析

高 雅,黄金田,冯心如,付 胜,高 娃,王文龙,,丁玉林,王金玲,*

(1.内蒙古农业大学兽医学院/农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特 010010;2.河套学院医学系/内蒙古自治区蜱媒人畜共患传染病重点实验室,内蒙古巴彦淖尔 015000)

猫传染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是由猫传染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)引起的一种慢性、渐进性、致死性的疫病[1]。而FIPV是由猫冠状病毒(Feline coronavirus,FCoV)部分基因突变而形成的。FCoV是单股正链有囊膜结构的RNA病毒,属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(Alphacoronavirus)[2]。FIP以实质器官表面出现中度至重度多灶性至融合性脓性肉芽肿性腹膜炎、大量腹水积聚为主要特征。FCoV多感染家养或野生的不同年龄段的猫科动物[3]。FCoV有高度的传染性,主要通过粪-口途径传播。根据病毒中和抗体反应和跨膜棘突基因(S)编码的氨基酸序列的差异性,FCoV分为2种血清型,即猫冠状病毒Ⅰ型(FCoV Ⅰ)和猫冠状病毒Ⅱ型(FCoV Ⅱ)型[4]。根据致病性,FCoV分为2种生物型,即猫肠道冠状病毒(Feline enteric coronavirus,FECV)和FIPV[5]。FECV和FIPV都存在于血清型FCoV Ⅰ和FCoV Ⅱ中。FCoV Ⅰ和FCoV Ⅱ均可引起FIP[6]。N基因高度保守,目前还没有报道揭示N基因的突变导致FECV向FIPV转变的影响[7]。FIPV 7ab属于非结构蛋白中的辅助蛋白,Dedeurwaerder A等[8]的研究发现FIPV 7ab在单核细胞和巨噬细胞中的复制起关键作用。本研究采用尸体剖检、组织病理学观察和免疫组织化学方法确诊了内蒙古呼和浩特市2例自然死亡FIP病例,并对2例FIPV ORF 7ab、N和S基因进行遗传进化分析,以期阐明FIPV基因遗传进化规律,为FIPV的深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 2只病死猫尸体,病例号分别为IMAU No.11685(3岁公猫)和IMAU No.11824(5月龄母猫),由呼和浩特市某宠物医院提供。

1.1.2 主要试剂 鼠抗FIPV N蛋白单克隆抗体(货号:20200903),武汉金开瑞生物工程有限公司产品;小鼠SAP试剂盒(货号:SAP-9100),北京中杉金桥生物技术有限公司产品;病毒DNA/RNA提取试剂盒、一步法逆转录PCR试剂盒、DNA标准DL 2 000,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 组织脱水机(Tissue-TeK®VIPTM5Jr)、组织包埋机(Tissue-TeK®TECT),日本Sakuar樱花公司产品;PCR扩增仪(C1000 TouchTM)、全自动凝胶成像分析仪(GelDoc),德国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 尸体剖检 对病死猫进行系统尸体剖检,观察并记录大体病变。剖检过程中分别取全身各组织器官,大小约2 cm×1 cm×0.5 cm,立即放入100 mL/L中性福尔马林溶液中固定。同时无菌取肝脏、肠道和腹水等新鲜样品,放入-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2.2 病理组织学切片的制备与观察 将固定24 h后的组织取出,按1.5 cm×1 cm×0.3 cm进行修块,梯度脱水和透明,石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(HE)染色,显微镜下观察。

1.2.3 免疫组织化学(IHC) 取1.2.2中制备的各组织切片,按免疫组化常规步骤进行试验。一抗为FIPV N蛋白单克隆抗体。阴性对照使用PBS代替一抗,AEC显色,甘油明胶封片观察。

1.2.4 RNA的提取 按病毒RNA提取试剂盒使用说明书分别提取2例猫肠道和肝组织总RNA,将所提取的RNA存放于-80 ℃超低温冰箱保存备用。

1.2.5 病毒鉴定引物合成 参考GenBank上发表Feline coronavirus strain HLJ/HRB/2016/13(登录号:KY566211.1)分别设计ORF 7ab、N和S基因3对特异性引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.6 ORF7ab、N基因以及S基因序列扩增 将提取好的RNA按一步法RT-PCR试剂盒说明书对FIPV ORF 7ab、FIPVN、FIPVS基因进行序列扩增。产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。测序结果用Mega 6生物分析软件的Maximum Likelihood Method法,通过1 000次重复计算引导值构建系统发育树绘制系统发育树,分析2例FIPV ORF 7ab、N和S遗传进化规律。代表性参考毒株序列从GenBank检索获得。

2 结果

2.1 尸检病变

2个病例的大体病变相似,腹围均明显增大,腹腔内积满少量丝网状黄绿色渗出物的黄色透明的较黏稠的腹水,腹膜面附着大量丝网状、片状黄绿色纤维素性渗出物(图1A)。肝脏(图1B)、肾脏、脾脏、肠道浆膜、网膜、输尿管和膀胱等器官表面散在或弥漫附着针尖大小至小米粒大小的灰白色结节状病灶。全身皮肤黏膜黄染,肠系膜淋巴结充血、肿大潮红。肺脏肿胀,表面湿润有光泽,肺尖叶、心叶和膈叶表面弥漫分布小叶性或小叶性融合性的肌肉样深红色实变区。

A.腹腔; B.肝脏

2.2 病理组织学变化

脾脏、肝脏、淋巴结、胰腺、胃、肠道、输尿管等脏器浆膜面呈结节状或弥漫性增厚。脾脏、肝脏间皮细胞局灶性明显增生,结节性病灶由大量的淋巴细胞、巨噬细胞、少量浆细胞、中性粒细胞和肉芽组织及表面少量纤维素构成;弥漫性增厚区域为上述成分的散在无序或呈灶性分布构成(图2A)。轻度至中度的坏死性肠炎,小肠绒毛上皮细胞坏死。间质性胰腺炎(图2B),胰腺水肿,胰腺小叶间质明显增宽,可见大量巨噬细胞、少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润,与脏器浆膜表面病灶内细胞成分一致,近被膜处腺泡散在性坏死。间质性肺炎,肺充血和水肿,肺泡间隔增宽,近细支气管肺泡间隔增宽明显,Ⅱ型肺泡上皮细胞增生明显,并部分脱落。轻度急性脾炎、轻度至中度间质性肾炎和间质性心肌炎。

2.3 IHC结果

在2个病例脾脏巨噬细胞浆内、胰腺腺泡细胞浆内发现特异性FIPV阳性信号(图3A)。在IMAU No.11685号病例的肠绒毛上皮细胞、肠腺上皮细胞、结节性炎性灶的巨噬细胞(图3B)、肝细胞、肾小管上皮细胞和颌下腺腺泡上皮细胞浆内发现特异性FIPV阳性信号。IMAU No.11824号病例的肠固有层巨噬细胞、淋巴结巨噬细胞的胞浆内均发现特异性FIPV阳性信号。其中IMAU No.11685号病例出现的阳性信号数量较多、强度更大。

A.胰腺滤泡;B.小肠浆膜面(IHC,标尺=20 μm)

2.4 PCR和测序结果

PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,获得预期ORF 7ab、N和S基因目的片段(图4)。经测序,ORF 7ab、N和S基因分别为1 128、1 134、2 252 bp。

M.DNA标准DL 5 000;1.IMAU No.11685 N;2.IMAU No.11824 N;3.IMAU No.11685 7ab;4.IMAU No.11824 7ab;5.IMAU No.11685 S;6.IMAU No.11824 S;7.阴性对照

2.5 基因遗传进化分析

2.5.1 FIPV ORF 7ab基因遗传进化分析 IMAU No.11685和IMAU No.11824的ORF 7ab基因同属于FCoV Ⅰ型。核苷酸序列分析结果表明,IMAU No.11685和IMAU No.11824在2个病例之间同源性为94.3%,同与2016年浙江杭州ZJU1709毒株(MT239440)同源性最高分别为94.1%和95.4%。亲缘关系最近,位于同一个进化分支内。与其他参考毒株的核苷酸同源性分为88.2%～93.9%和85.3%～95.2%。

2.5.2 FIPVN基因的遗传进化分析 IMAU No.11685和IMAU No.11824N基因同属于FCoV Ⅰ型。2个病例之间N基因核苷酸同源性为88.5%。IMAU No.11685的N基因序列与2016年浙江杭州ZJU1617(MT239439.1)毒株同源性最高为91.1%,亲缘关系最近,位于同一个进化分支内。与其他参考毒株的核苷酸同源性为82.9%～90.5%。IMAU No.11824的N基因序列与2018湖北武汉QS毒株(MW030108)同源性最高为92.4%,亲缘关系最近,位于同一个进化分支内。与其他参考毒株的核苷酸同源性为82.2%～92.3%。

2.5.3 FIPVS基因的遗传进化分析 IMAU No.11685和IMAU No.11824病毒S基因同属于FCoV Ⅰ型。2个病例之间S基因核苷酸同源性为89.0%。同与2018年湖北武汉毒株QS(MW030108)毒株同源性最高分别为89.5%和88.8%,亲缘关系最近,位于同一个进化分支内。与其他参考毒株的核苷酸同源性分为59.8%～89.3%和57.1%～88.6%。

3 讨论

2019年新型冠状病毒在全球传播后,人们越来越重视对冠状病毒的研究[9]。FIPV属于属ɑ-冠状病毒属的成员之一,易感猫科动物[10]。基于FIP病变特征可将其分为渗出型、非渗出型和混合型。在自然感染病例中,渗出型比非渗出型和混合型更普遍。强烈的体液免疫与渗出型有关,较强的细胞免疫反应会导致非渗出型[11]。渗出型FIP通常见于非渗出型FIP的终末期,反映了免疫系统的崩溃[12]。FIP的典型尸检表现为纤维素性肉芽肿性浆膜炎、腹腔内富含蛋白质的浆液性积液、多器官的表面出现脓性肉芽肿性病变[13]。FIP的特征性组织病理学表现为全身血管周围呈多灶性至凝聚性脓性肉芽肿性病变[14]。本研究2个FIP病例在腹腔内可见大量黄色透明的较黏稠的伴有少量丝网状黄绿色渗出物的腹水,具有渗出性FIP的典型病理变化,还具有非渗出型FIP典型病变,即在腹膜面上出现大小不等的结节状炎性细胞浸润灶。免疫组织化学染色结果显示在浆膜面炎性细胞浸润灶、脾脏和淋巴结的巨噬细胞浆内,以及肠上皮细胞浆和胰腺腺泡上皮细胞浆内可见明显的FIPV阳性信号。综上所述,本研究的2例病猫均为混合型FIP。值得一提的是,2个病例出现轻度至严重的间质性胰腺炎,在胰腺腺泡细胞内FIPV阳性信号较强,说明胰腺可能是FIPV的重要靶器官。

研究表明,FCoV缺乏ORF 7b基因,因此不能产生ORF 7b蛋白产物,而FIPV有ORF 7b基因,产生这种蛋白会产生抗体反应[15]。N基因是FIPV中的保守基因,其稳定性使其成为FCoV检测的理想靶基因。通过检测FCoVN基因并结合特征性的临床症状是确诊FIP的常用手段[16]。FIPV的突变通常与S基因的突变有关,FCoVS基因的突变导致病毒的细胞嗜性发生变化[17]。本研究通过对两例的ORF 7ab、FIPVN和FIPVS基因的扩增并进行遗传进化分析,结果显示,2例核苷酸序列均发生变异,FIPVS基因与国内外其他毒株核苷酸同源性差异最大,说明S基因是FIPV遗传进化过程中突变的主要区域。S基因编码的刺突蛋白是宿主被病毒感染的关键因素,推测其为适应不同地域宿主而产生的突变从而表现出进化差异。

在自然感染的猫中发现的绝大多数野外毒株是FCoV Ⅰ型毒株。其中FCoV Ⅰ型毒株在欧洲和美国感染率高达80%～95%[18],FCoV Ⅱ毒株感染较少见,在亚洲地区FCoV Ⅱ毒株感染率高达25%[19]。Duarte A等[20]研究了葡萄牙地区猫种群中FCoV的分型分布,在2004-2006年间,采集了120份样本,其中57份显示FCoV阳性。在阳性样本中,FCoV Ⅰ型占79%,FCoV Ⅱ型占3.5%。Shiba N等[21]采用病毒中和试验对日本猫群FCoV的感染进行分型,结果显示在50份FCoV阳性的血清样本中,FCoV Ⅰ型占98%,FCoV Ⅱ型占2%。Wang Y T等[22]对中国台湾某教学医院833例病例进行不同类型FCoV感染流行情况调查。结果发现主要以FCoV Ⅰ型感染为主,血清阳性率为70.4%,FCoV Ⅱ型感染率仅为3.5%。 Li C等[23]报道,在中国黑龙江地区FIP样本共搜集到126份,其中FCoV Ⅰ型占95.8%,FCoV Ⅱ型占4.2%。以上这些数据表明,在不同的国家和地区,FCoV的流行情况有明显差异,但均以FCoV Ⅰ型毒株流行为主。本研究的2例各基因遗传进化分析结果表明,2例均属于FCoV Ⅰ型毒株,IMAU No.11685与浙江毒株(MT239440)同源性最高,IMAU No.11824与武汉毒株(MW030108)同源性最高,研究的2个病例FIPV与国内流行毒株起源于共同祖先。