黄牛源Fh/Fg杂合型片形吸虫的鉴定

李小军,姜龙龙,吕超超,闫文朝

(1.河南科技大学动物科技学院,河南洛阳 471023;2.济源市动物卫生监督所,河南济源 454650)

片形吸虫隶属于复殖目的片形科片形属,是反刍动物体内的常见寄生虫。牛、羊等动物感染片形吸虫后因肝脏功能紊乱导致生产力下降,给畜牧业造成较为严重的经济损失[1]。肝片形吸虫还可感染人,全球有高达9 000万人面临片形吸虫感染的风险[2]。

片形吸虫主要是肝片形吸虫(Fasciolahepatica)和大片形吸虫(F.gigantica)。近年来,在埃及、伊朗、日本、韩国和中国等地发现有杂合型片形吸虫[3-5]。由于肝片形吸虫与大片形吸虫的大小指标实际上存在相当大的变化及重叠,传统形态学分类对于二者的准确鉴定和区分是不可靠的[4]。PCR和测序等分子技术已应用于片形吸虫的鉴定和分类[6]。目前用于片形吸虫种类鉴定的分子标记主要有核糖体和线粒体DNA序列。其中的核糖体小亚基的第1和第2内转录间隔区(ITS1、ITS2)和线粒体cox1、nad1基因常被用于片形吸虫的种类鉴定[5-7]。

据文献报道,河南省奶牛中存在肝片形吸虫和大片形吸虫[8-9],但目前尚未见杂合型片形吸虫的报道。本研究对济源地区1例黄牛感染的片形吸虫在形态学鉴定基础上,对虫体的核糖体ITS1、ITS2以及线粒体cox1、nad1基因进行PCR扩增、测序和序列分析,确定了其种类,为片形吸虫病的流行病学及其防控补充了基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 2019年10月从河南省济源市某肉牛屠宰厂采集疑似片形吸虫感染的肝脏,带回实验室进行检查。从肝脏中采集到片形吸虫虫体,保存于70%乙醇,4 ℃保存备用。

经流行病学调查,该病牛为3岁本地黄牛,生前消瘦,常年在济源市太行山区放牧生活。

1.1.2 主要试剂 基因组DNA提取试剂盒,天根生化科技(北京)有限公司产品;2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans2K®DNA Marker和核酸染料GelStain,北京全式金生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 PCR扩增仪(Genesy 96T),西安天隆科技有限公司产品;电泳仪DYY-6C,北京六一生物科技有限公司产品;凝胶成像仪(Tanon-2500),上海天能科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 肝脏病变与虫体形态的观察 眼观肝脏的大体病理变化。肉眼及解剖镜观察虫体的形态结构,直尺测量虫体的大小,参考相关文献[10]对虫体种类进行初步的形态学鉴定。

1.2.2 虫体基因组DNA提取 挑取4条形态大小差异较大的虫体用于DNA的提取,分别命名为JY001～JY004。参考文献所述方法[11]处理虫体后按照组织DNA提取试剂盒说明书提取虫体DNA,保存于-20 ℃冰箱,备用。

1.2.3 PCR扩增 采用参考文献[7,12-13]报道的引物分别扩增片形吸虫的核糖体ITS1和ITS2区域、线粒体基因nad1和cox1,引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应体系为25 μL,包括2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、上游引物和下游引物(10 pmol/μL)各1 μL、灭菌超纯水8.5 μL和模板2 μL。反应程序为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55～57℃(表1) 30 s,72 ℃ 30～60 s(表1),共35个循环;72 ℃ 7 min。取5 μL PCR产物,10 g/L琼脂糖凝胶电泳后,用凝胶成像仪观察结果并拍照。

表1 片形吸虫PCR检测引物

1.2.4 测序与序列分析 将阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行双向测序。将所得序列用软件Chromas和DNA Star 7.1 SeqMan校对拼接,在NCBI网站上进行Blast,对本研究所得序列与GenBank中序列相似性作初步分析。利用软件BioEdit、DNA Star 7.1 MegAlign对所得序列和片形吸虫的参考序列进行截短和序列比对。利用软件MEGA 6以邻接法构建nad1和cox1基因的遗传进化树,作Bootstrap分析,重复次数设置为1 000次。

本研究获得的黄牛源片形吸虫代表分离株JY004的ITS1、ITS2、cox1和nad1基因序列已提交至GenBank,登录号分别为OP850829、OP850586、OP837076和OP837184。

2 结果

2.1 肝脏病理变化及虫体形态观察结果

肉眼观察,病牛肝脏肿大,可见明显结节囊肿。切开结节囊肿,胆管内可见淡黄色脓性分泌物和黑色钙化块状物。从胆囊和胆管中分离的虫体呈淡红色片状,虫体肥厚,大小为(27～44) mm×(7～16) mm,平均长宽比为2.73(测量了12个完整虫体的数据)。虫体头锥明显,靠近前端有口吸盘和腹吸盘,二者距离较近,虫体前宽后窄,两侧不平行,肩部特征不明显。该形态学符合片形吸虫的特征,但尚不能准确定种。

2.2 PCR扩增结果

对提取的4份DNA样品JY001～JY004进行PCR扩增,得到了ITS1、ITS2、nad1和cox1的条带,分别约为600、470、619、474 bp(图1),均与预期大小相符。

A～D.ITS1、ITS2、nad1、cox1; M.DNA标准DL 2 000; 1～4.JY001-JY004

2.3 分子鉴定结果

根据测序结果,JY001和JY002两份样品的ITS1、ITS2测序色谱图存在较多噪音信号,无法获得完整可靠的序列,剩余两份样品JY003和JY004四个基因均获得完整准确序列。因此,选择样品JY003和JY004用于后续序列比对分析和进化树构建。

2.3.1 ITS1和ITS2序列分析结果 序列比对结果显示,JY003和JY004的ITS1序列和ITS2序列均完全一致。JY003和JY004的ITS1序列与大片形吸虫序列相似性在99.5%以上,与肝片形吸虫序列相似性为98.9%～99.2%。测序色谱图显示,这两份样品在6个位点存在杂合套峰,且每个杂合位点的碱基与肝片形吸虫和大片形吸虫的碱基一致(表2和图2)。

▲:所指为杂合位点,出现套峰

表2 片形吸虫ITS1核苷酸变异情况

JY003和JY004的ITS2序列与肝片形吸虫和大片形吸虫序列相似性均在98.8%以上。测序色谱图显示,这两份样品有4个位点存在杂合套峰,且每个杂合位点的碱基与肝片形吸虫和大片形吸虫的碱基一致(表3)。

表3 片形吸虫ITS2核苷酸变异情况

根据ITS1和ITS2序列分析结果,参考有关文献,提示河南济源片形吸虫分离株JY003和JY004为杂合型片形吸虫。

2.3.2nad1和cox1基因序列分析结果 JY003与JY004的nad1基因序列相同。二者与GenBank上已发布的肝片形吸虫序列的相似性为91.4%～91.6%,与大片形吸虫序列相似性为96.8%～100%,其中与大片形吸虫中国云南、日本和韩国分离株的序列相似性高达100%。在系统进化树上,JY003和JY004与大片形吸虫处于同一分支上(图3)。

图3 基于片形吸虫nad1基因构建的系统进化树

JY003与JY004的cox1基因序列也相同。二者与GenBank上已发布的肝片形吸虫序列的相似性为93.1%～93.4%,与大片形吸虫序列相似性为97.3%～99.2%,其中与大片形吸虫越南和泰国分离株的相似性达99%以上。在系统进化树上JY003和JY004与大片形吸虫处于同一分支(图4)。

图4 基于片形吸虫cox1基因的系统进化树

3 讨论

片形吸虫病是危害牛、羊等反刍动物的常见寄生虫病,也是一种重要的人畜共患病[2]。片形吸虫主要是肝片形吸虫和大片形吸虫,也有近年来发现的位于二者之间的杂合型[5,13-14]。片形吸虫成虫的头锥、肩部和长宽比等特征常作为形态学种类鉴定的指标,但由于虫体发育阶段等因素会影响其形态学鉴定的准确性[4,15]。本研究对采集到的河南省济源市本地黄牛肝脏中片形吸虫虫体,首先通过传统形态学观察,发现其与片形吸虫的形态特征基本吻合,但由于肩部特征不明显,虫体两侧不平行,未能确定其为何种片形吸虫。为更确切地鉴定其种类,从分子水平上做了进一步鉴定。

针对片形吸虫的ITS1和ITS2区域,我们对河南济源黄牛源分离株进行了分子鉴定,结果为Fh/Fg杂合型片形吸虫。相较与核糖体DNA,线粒体基因如nad1和cox1系母系遗传,具有进化速率较快,不易发生基因重组等特点,也被广泛用于片形吸虫的种类鉴定和遗传进化分析[6,5],但无法区分片形吸虫是否存在杂合型[13-15]。因此,本研究除了用标记分子ITS1和ITS2外,还利用线粒体nad1和cox1基因进行序列和遗传进化分析。分析结果显示,济源黄牛源分离株JY003和JY004的nad1和cox1基因均与大片形吸虫进化关系最近,其中nad1序列与大片形吸虫中国云南、日本和韩国分离株相似性高达100%。这表明本研究分离的黄牛源片形吸虫分离株为大片形吸虫作为母系的Fh/Fg杂合型片形吸虫。

一般认为中国南方反刍动物和人群感染大片形吸虫,北方地区流行肝片形吸虫[5,16-17]。后来发现,肝片形吸虫和大片形吸虫地理隔离性已被打破,在黑龙江、吉林、云南、广西、福建、贵州、湖北、湖南、广东和青海等地区均存在Fh/Fg杂合型片形吸虫,其中大片形吸虫作为母系的Fh/Fg杂合型片形吸虫占据优势地位[13-15,18]。Ichikawa-Seki M等[19]分析了来自中国各地共211株片形吸虫,发现Fh/Fg杂合型片形吸虫为优势虫株,占比高达63.0%。本研究从中原地区黄牛体内发现存在Fh/Fg杂合型片形吸虫,进一步验证了“Fh/Fg杂合型片形吸虫成为中国大陆流行的优势虫株”的推论。

有关河南地区动物片形吸虫感染情况的报道很少。李明[8]曾对济源地区奶牛肝片形吸虫感染情况做过调查,基于nad1基因分析结果显示,奶牛肝片形吸虫感染率为5.42%。刘复生报道[9],基于nad1基因分析表明,河南省中牟县奶牛存在大片形吸虫和肝片形吸虫。由于上述两项调查研究仅采用线粒体基因nad1进行分子鉴定,无法鉴定出Fh/Fg杂合型片形吸虫。本研究采用核糖体和线粒体标记分子对来自河南省济源市本地黄牛的虫株进行分子鉴定,首次确定了在河南地区存在Fh/Fg杂合型片形吸虫,为我国片形吸虫的流行病学研究提供了重要补充,为动物和人片形吸虫病的防控提供了重要的基础数据。