动物骨骼标本制作中脱脂漂白方法的探讨——以羊驼骨骼为例

丁常根,杨兴林,冯 平

(榆林学院,陕西榆林 719000)

动物骨骼标本作为医学院和兽医学院的必备教具,被广泛应用于教学与科普[1]。常见的动物骨骼标本有3种,即附韧带骨骼标本、透明双染色骨骼标本、关节分离式骨骼标本[2]。附韧带骨骼标本使用年限短,韧带容易断裂致使骨骼散架。透明双染色骨骼标本利用阿尔新蓝、不同浓度梯度的酒精或甲醇、胰蛋白酶、茜素红使骨骼显现出蓝色与红色,使软组织透明,以此方便观察[3]。关节分离式骨骼标本具有不易损坏的优点,在实际生活中更为常见。

在关节分离式骨骼标本的制作过程中,脱脂是重要的环节,常用物理和化学方法进行脱脂。物理脱脂的方法有高压蒸汽灭菌锅蒸煮和超临界CO2处理[4]。有学者研究表明,高温煮沸会增加鲸鱼骨骼孔隙率,超临界CO2萃取使骨骼中的哈佛斯管产生细小裂纹,两种方法都会对骨骼的胶原蛋白造成不可逆的损伤[5-6]。脱脂的化学试剂有汽油、工业酒精、丙酮、环已酮、甲醛/氯仿、天那水、二甲苯、醋酸戊酯、十二烷基苯磺酸钠[7-9]。用FT-拉曼光谱及气相色谱开展氯化溶剂和丙酮对骨骼的脱脂试验,氯化溶剂会使骨骼变脆并产生细小裂纹,丙酮脱脂仅作用于骨骼表面,对骨骼内部脱脂作用不显著[10]。对鱼类骨骼采用氨水进行脱脂,氨水对小型骨骼具有良好脱脂效果,大型骨骼用氨水可以辅助脱脂;对绵羊骨骼用氨水防止泛油腐蚀,结果显示,氨水对动物骨骼的脱脂不彻底具有较好防止泛油的效果;在羊骨骼的脱脂处理中用汽油进行初步脱脂,其次取90 ℃的热水进行浸泡,浸泡过程中添加氨水进一步脱脂,此时热水中有气泡冒出,冒泡停止后,脂肪全部脱出[11-12]。

本研究运用关节分离式骨骼标本制作方法,用氨水作为脱脂溶剂对210日龄雄性羊驼骨骼进行脱脂试验,探索骨骼标本在使用过程中不腐烂变质、不泛油变黄的骨骼脱脂新方法,以期为骨骼标本的制作提供新的参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用骨骼 选取210日龄雄性羊驼大小相近的10对肋骨及其他部位的骨骼。

1.1.2 主要试剂 氢氧化钠(批号:20210508),天津科密欧化学试剂有限公司产品;过氧化氢片剂(批号:20210927),昌乐鑫富强有限公司产品;氨水(批号:20200707),烟台远东精细化工有限公司产品;蒸馏水由榆林学院生命科学学院实验室提供。

1.1.3 仪器与设备 解剖手术台、电子天平、浸泡箱、恒温箱,均由榆林学院生命科学学院实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 动物预处理 ①取210日龄雄性羊驼沿腹中线打开腹腔去除内脏,进行清水冲洗,以四肢、颈部、头部依次取下,逐一剔除骨骼各部位上的软组织,解剖过程中舌骨、腕骨、籽骨、胸骨柄等细小骨要保留[13]。②剥离好的骨骼依照骨骼的大小、密度、骨髓腔容量放入1～3号浸泡箱内,头骨、颈椎、胸椎、腰椎、荐骨置1号浸泡箱,前肢骨置2号浸泡箱,后肢骨、骨盆置3号浸泡箱。同时肋骨、胸骨、舌骨、尾椎、腕骨、籽骨等细小骨分类置于各纱布袋内[14],置入烧杯内。将现配制的20 g/L NaOH溶液对骨骼进行初步脱脂腐蚀,浸泡箱内NaOH溶液以没过骨骼为准,分别加入配制好的NaOH溶液。1～20号烧杯内肋骨斜置,各加入1 L配制好的NaOH溶液使肋骨完全浸于溶液当中。21号烧杯内细小骨与所剩6根肋骨加入配制好的NaOH溶液。经肉眼观察残余肌肉呈透明胶冻样后,对骨骼浇注约85 ℃的热水,长骨两端打孔,利用注射器清水冲洗后,将配制的20 g/L NaOH溶液注入到长骨内骨髓腔。再于NaOH溶液中浸泡10～12 h,后清水冲洗,清除残余肌肉并剔除蹄部角质层,暴露骨骼,为脱脂漂白试验做好准备。腐蚀脱脂完成后,根据骨骼大小、密度和骨髓腔容量,将骨骼分为后肢骨、前肢骨、头骨、肋骨、细小骨等5类,并置于不同的容器。

1.2.2 骨骼脱脂漂白 ①选取羊驼肋骨13对中的10对大小相近的肋骨,将20根肋骨依次置入1号～20号烧杯内,随机为分4组。同时制备浓度为2、4、6、8、10 mL/L氨水与100 mL/L H2O2混合溶液,将其1组的每件烧杯分别加入1 L制备好的混合溶液置于20 ℃的恒温箱内反应,其反应时间设为4 h(其余组将温度依次设为25、30、35 ℃,其浓度、液体量、时间等其他条件不变)。观察不同条件下的脱脂效果。②对筛选到的最适氨水浓度及温度,其室温与恒温箱温度相近时,骨骼可在室内进行脱脂,将后肢骨、前肢骨、头骨、所剩肋骨、细小骨为标志性骨骼与全身其他骨骼分类置于不同的浸泡箱,添加溶液使骨骼完全浸于溶液中进行脱脂漂白处理,观察各浸泡箱内骨骼的脱脂时间。

2 结果

2.1 不同温度、氨水浓度处理结果

25～30 ℃时6 mL/L的氨水皂化反应可控且不损伤肋骨,1 h后反应明显,大量白色泡沫析出,泡沫表面附有脂滴,用玻璃棒进行缓慢搅拌使骨骼充分与药品发生反应。在温度相同情况下,氨水浓度越高,反应越迅速,氨水浓度过高对肋骨表面产生损伤,对肋体损伤较大,肋头次之。在温度不同,氨水浓度相同的情况下,低温无法对肋骨有效脱脂漂白,并对肋骨表面造成了损伤(表1)。

表1 反应4 h条件下不同浓度、不同温度的氨水与100 mL/L H2O2的混合溶液对肋骨的处理效果

2.2 不同部位骨骼在氨水中的处理时间和效果

25～30 ℃、6 mL/L氨水对不同类型骨骼脱脂漂白显示,后肢骨9 h可完成脱脂漂白,前肢骨8 h可完成脱脂漂白,头骨6 h可完成脱脂漂白,籽骨、腕骨、髌骨、尾椎、胸骨柄等细小骨骼,2 h可完成脱脂漂白,表明骨骼的大小、密度、骨髓腔容量会影响到脱脂漂白的时间,且呈正相关性(表2)。

表2 氨水对不同部位骨骼脱脂漂白的效果

3 讨论

氨水为无机溶剂,与有机溶剂相比,H2O2漂白过程中添加氨水能与油脂产生皂化反应,不同于NaOH的皂化反应,强碱作用在暴露骨质的骨骼其损伤较为严重,而氨水为弱碱对骨骼损伤较小。本研究通过氨水与H2O2的混合溶液对羊驼骨骼的处理,发现温度在25～30 ℃反应可控且不损伤骨骼。此外,在25～30 ℃的条件下发现当氨水的浓度过高或室内温度过高,皂化反应明显增强,同时室外阳光充沛的条件下自然光的直射,会导致皂化反应剧烈,制作过程中需关注自然条件造成的影响,必要时需迅速将骨骼取出并重新配制溶液。

漂白作为较多动物骨骼标本所必需的环节,H2O2浓度超过200 mL/L会造成骨骼的损伤,H2O2浓度对于不同动物不同部位的骨骼、薄厚、骨质及其抗侵蚀的性质也均有差别[15],按照动物体型、骨密度、骨髓腔容量等原则合理控制H2O2浓度在30～100 mL/L[16],可降低对骨质的影响。

NaOH作为骨骼脱脂腐蚀的重要试剂,其不仅能够去除残留在骨骼凹槽缝隙处的肌肉,同时还可将脂肪水解成甘油和脂肪酸盐,对去除骨骼表面的油脂有一定的成效[17-18]。本试验羊驼骨骼利用NaOH处理后其表面均有油污残留,其中较小的骨骼表面油脂处理有一定效果,而长骨骨骼表面残留有较多油污和不规则小黄点,说明NaOH可作为油脂处理的辅助方法,但其主要作用是去除骨骼缝隙内残余筋肉。

动物骨骼标本制作时,未完全脱脂的骨骼,油脂会缓慢渗出,极易滋生细菌污染,影响骨骼标本的使用寿命[19]。动物骨骼的质量也会影响到骨骼标本的使用和保存年限,老龄动物骨骼往往伴有纤维质骨化,骨骼内黄骨髓过多,难于溶解,骨髓中含有大量饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸,是造成骨骼标本发生霉变、发黑、散发酸臭味等造成使用年限缩短的主要诱因,而幼龄动物骨骼发育不完善,部分骨骼发育未愈合,不适于制作为骨骼标本。为了避免动物本身对骨骼标本造成的影响,选择试验动物方面,成年动物相比老龄动物与幼龄动物更易制作骨骼标本[20-22]。

羊驼骨骼以6 mL/L氨水与100 mL/L H2O2混合,25～30 ℃脱脂漂白效果较好,其脱脂漂白的时间与骨骼的大小、密度、骨髓腔容量呈正相关性。通过对羊驼全身骨骼的脱脂漂白处理,为脱脂的方案增添了新的选择,同时填补了制作羊驼骨骼标本资料上的空白。