内蒙古某奶牛场两种致犊牛腹泻原虫的鉴定及遗传进化分析

刘 鼎,梁高星,房凯敏,任 尊,牛雨薇,吴敏楠,宋军科

(西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100)

犊牛腹泻是犊牛生长过程中的一种常见疾病,严重威胁牛养殖业的健康发展,其病因错综复杂,包括环境、营养等非感染性因素,以及细菌、病毒和寄生虫等病原感染因素[1]。由寄生性肠道原虫病所致的犊牛腹泻,常被误诊为其他疾病,使病畜得不到合理的救治,给饲养场造成了巨大的经济损失[2]。蓝氏贾第虫(Giardialamblia)和隐孢子虫(Cryptosporidiumsp.)为2种常见的人兽共患肠道原虫,不仅可以引起犊牛腹泻,甚至严重威胁着人类健康,因此探明这些肠道原虫在腹泻犊牛中的感染情况十分必要[3]。

隐孢子虫和蓝氏贾第虫的基因型和种类的分子特征对于病原的准确鉴定和评估人畜共患传播至关重要[4]。报道显示,可感染牛的隐孢子虫共有十几种,其中常见的有微小隐孢子虫(C.parvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、芮氏隐孢子虫(C.ryanae)以及牛隐孢子虫(C.bovis),其他隐孢子虫虫种在牛体内也零星地被发现[5]。目前研究已证明蓝氏贾第虫存在8个集聚体(A～H),其中可感染包括人在内的多种哺乳动物的集聚体A和B被认为是人兽共患基因型;而集聚体E则常见于偶蹄类动物,但是在埃及也曾发现人类感染蓝氏贾第虫集聚体E[6]。

本研究利用分子生物学技术分别对隐孢子虫和蓝氏贾第虫的SSUrRNA和BG基因位点进行PCR扩增、序列对比和遗传进化分析,明确隐孢子虫和蓝氏贾第虫在犊牛腹泻中的作用,本研究结果可为该地区犊牛腹泻的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 18份(样品编号:NMX1～NMX18)腹泻犊牛(2～3月龄)的新鲜粪便,均采自于内蒙古某奶牛场,采集时间为2021年12月份,采集后的粪便样品在冰盒中运回实验室,置4 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂 粪便基因组DNA试剂盒E.Z.N.A.®Stool DNA Kit,美国Omega公司产品;琼脂糖,擎科新业生物技术有限公司产品;6×Loading buffer、DNA标准DL 2 000,宝生物工程(大连)有限公司产品;2×RapidTaqMaster Mix,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 电子天平,日本Shimadzu公司产品;显微镜,日本Nikon公司产品;超纯水制造仪,四川优普超纯科技有限公司产品;网筛(60目),宇晨化玻站产品;单道移液器(100～1 000 μL),大龙兴创实验仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 显微镜检查 取新鲜粪样5 g,加10倍蒸馏水,搅匀用网筛过滤粪样至烧杯中,分装粪便至50 mL离心管中,以3 500 r/min离心10 min,倒掉部分上清液,剩余上清液与沉淀体积相当,将剩余上清液及沉淀用玻璃棒搅匀,加等体积乙醚,摇匀后3 500 r/min离心10 min,倒掉脂肪层,留沉淀物加水至5 mL,加饱和蔗糖溶液至35 mL,摇匀后3 500 r/min离心7 min。用铁丝环钓取表层液膜制片,置400倍显微镜下检测。

1.2.2 粪便DNA的提取 根据E.Z.N.A.®Stool DNA Kit粪便基因组提取试剂盒说明书,从粪便样品中分别提取基因组DNA,并将提取到的DNA分装,置-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增 基于隐孢子虫小亚基核糖体RNA(SSUrRNA)基因,参照文献[7]设计的2对引物,通过套式PCR扩增830 bp左右片段的基因序列筛选隐孢子虫阳性样品;基于蓝氏贾第虫BG基因序列,参照文献[8]设计的2对引物,通过套式PCR扩增511 bp左右片段的基因序列筛选蓝氏贾第虫阳性样品。PCR反应体系总体系为25 μL,包括12.5 μL 2×RapidTaqMaster Mix、8.5 μL双蒸水、上、下游引物(25 pmol/μL)各1 μL、2 μL模板DNA。PCR扩增程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s,72 ℃ 20 s,共30个循环;72 ℃ 5 min,降至16 ℃结束。引物序列及退火温度见表1,所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳,摄像记录结果后,将电泳检测阳性的第2轮PCR反应产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

表1 引物序列

1.2.4 序列分析 将测得的基因序列使用Clustal X 1.83软件进行比对,并参考图谱校准,将校准后的序列上传至NCBI使用Blast进行比对,下载匹配度较高的虫种序列作为参考序列,最后采用MEGA6.06中的Neighbor-Joining(N-J)法评估序列之间的系统发育关系。采用Kimura 2-parameter参数模型,引导分析使用1 000个重复/树进行。

2 结果

2.1 显微镜检测结果

通过显微镜观察经饱和蔗糖漂浮法处理后的粪便样品,观察到隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊,隐孢子虫卵囊呈卵圆形,大小约为4.9 μm×4.6 μm,在卵囊内卵囊残体明显,隐约可见4个子孢子;贾第虫包囊呈椭圆形,大小约为12 μm×8 μm,卢戈氏碘液染色后呈棕绿色,贯穿虫体长轴的轴柱和细胞核清晰可见(图1)。

A.隐孢子虫;B.蓝氏贾第虫(卢戈氏碘液染色)

2.2 PCR扩增结果

以18份粪便样品的DNA为模板分别进行Cryptosporidiumsp.的SSUrRNA基因位点和Giardialamblia的BG基因位点PCR扩增,1份样品扩增出Cryptosporidiumsp.的SSUrRNA基因位点的目的片段,长度约为830 bp左右,阳性率为5.56%(1/18),13份样品扩增出Giardialamblia的BG基因位点的目的片段,长度约为511 bp左右,阳性率为72.22%(13/18),阴性对照无条带(图2和图3)。

M.DNA标准DL 2 000;1～18.样品NMX1 NMX18;19.阴性对照

M.DNA标准DL 2 000;1～18.样品NMX1 NMX18;19.阴性对照

2.3 序列比对及分析

本研究对采集的18份犊牛腹泻粪便样品,基于SSUrRNA基因位点进行PCR扩增共得到的1份Cryptosporidiumsp.阳性样本NMX3,去除两端模糊序列后序列长度为728 bp,使用Blast工具进行比对分析发现检测得到的阳性样品为牛隐孢子虫(C.bovis),与GenBank数据库中序列号MK982466(孟加拉国分离株)、MG972763(马来西亚分离株)、MW788435(泰国分离株)和MF074597(中国分离株)均具有100%的序列同源性。

基于BG基因位点进行PCR扩增共得到13份Giardialamblia阳性样本,去除两端模糊序列后序列长度为448 bp,将所有序列通过NCBI使用Blast工具进行比对分析,检测得到的13份蓝氏贾第虫阳性样品均被鉴定为集聚体E型,其中NMX3、NMX5和NMX11与GenBank数据库中序列号MK610389有99.78%～100%的序列同源性,NMX8、NMX9和NMX16与GenBank数据库中序列号AY655703有99.78%～100%的序列同源性,NMX6、NMX12、NMX13和NMX14与GenBank数据库中序列号KY633469有99.78%～100%的序列同源性,NMX1和NMX18与GenBank数据库中序列号JX978261有100%的序列同源性,NMX7与GenBank数据库中序列号MH158457有100%的序列同源性。

2.4 种群遗传进化分析

牛隐孢子虫分离株SSUrRNA基因位点构建的系统进化发育树表明,本研究获得的C.bovis分离株与牛隐孢子虫(C.bovis,GenBank登录号:MK982466、MG972763、MW788435和MF074597)位于同一分支(图4)。蓝氏贾第虫分离株BG基因位点构建的系统进化发育树表明,本研究获得的13株Giardialamblia分离株与集聚体E(GenBank登录号MK610389、AY655703、KY633469、JX978261和MH158457)位于同一分支(图5)。

图4 牛隐孢子虫分离株SSU rRNA基因位点遗传进化树(Neighbor-Joining法)

图5 蓝氏贾第虫分离株BG基因位点遗传进化树(Neighbor-Joining法)

3 讨论

寄生性肠道原虫引起的犊牛腹泻与细菌或者病毒感染引起的犊牛腹泻临床症状相似,因此常被误诊,使病畜得不到有效的治疗,错过最佳治疗期并造成抗菌药物残留等问题[1]。其中,隐孢子虫和蓝氏贾第虫均为人兽共患原虫,在世界范围内广泛流行,宿主感染后排出的包囊和卵囊会污染周围环境,对动物和人类的健康生活均造成严重危害。

本研究中蓝氏贾第虫在犊牛腹泻粪便样品具有较高的检出率,阳性率为72.22%(13/18),低于广东断奶前小牛中蓝氏贾第虫74.2%(288/388)的感染率[9],普遍高于国内大多数研究者报道的数据[10-11]。感染情况的差异可能与采样动物年龄、健康状况及检测方法、标本采集时间、地理生态条件等多种因素有关[12]。此外,蓝氏贾第虫感染性和致病性与集聚体分类有密切联系,不同集聚体之间的生物学特性具有差异,本研究得到的13份蓝氏贾第虫阳性样品均被鉴定为集聚体E,该型常见于偶蹄类动物,但存在人类感染的报道,这说明蓝氏贾第虫不仅具有动物间互相传播的风险,而且极有可能危害人类的身体健康[5]。本研究中隐孢子虫在犊牛腹泻粪便样品中仅发现1例,阳性率为5.56%(1/18),且与蓝氏贾第虫为混合感染,检测得到的阳性样品被鉴定为牛隐孢子虫(C.bovis)。牛为哺乳动物中常见感染隐孢子虫的种类,在断奶之前的犊牛尤为易感,成为隐孢子虫病最重要的直接宿主之一[13]。犊牛隐孢子虫病呈世界性分布,且各地感染率之间具有很大差别,目前国内有多个省市已从牛粪便样品中鉴定出了隐孢子虫,感染率为1.0%～48.5%,其在国内的分布跨度较大,给养牛产业带来了很大威胁,严重制约养殖业的健康发展[14]。

本研究结果表明,蓝氏贾第虫和隐孢子虫是影响犊牛腹泻的重要因素,提示在犊牛腹泻时应综合考虑各种致病因素,采取综合性防控措施,加强防范意识,总结科学的防控措施,以降低犊牛感染该病的风险。