二丁提取散中半边莲的薄层色谱鉴别

付海宁,陈昱骁,陈 玲,张会梅,姚德勇,王艳玲,蔡青秀,章安源,尹伶灵,孙亚磊

(1.青岛动保国家工程技术研究中心有限公司,山东青岛 266111;2.山东省饲料兽药质量检验中心,山东济南 251412;3.青岛蔚蓝生物股份有限公司,山东青岛 266000)

非洲猪瘟自2018年传入我国后,给我国养猪业造成了严重的经济损失。目前,非洲猪瘟仍然是全国养猪行业死亡率最高的疾病。感染非洲猪瘟病毒的病猪表现为高热、精神沉郁、呼吸困难;耳、四肢、腹背部皮肤有红色至紫色出血块;眼、鼻有黏性或脓性分泌物;可视黏膜潮红发绀等症状[1-5]。为了寻找非洲猪瘟防控与治疗的解决方案,筛选得到二丁提取散,它是由紫花地丁、蒲公英、板蓝根、半边莲四味中药经提取、浓缩、干燥,辅以适宜的辅料制成的粉末状制剂。该处方来源于《中国药典》2020年版一部的“二丁颗粒”,具有清热解毒的功能,用于火热毒盛所致的热疖痈毒、咽喉肿痛、风热火眼[6]。二丁提取散拟用于非洲猪瘟的辅助治疗,以期达到清除病猪体内热毒,消炎止痛、缓解皮肤发绀症状的目的。

处方中的半边莲是中医药界有名的药草,为多年生草本植物,高约20 cm,茎为圆形,全株光滑无毛,呈平卧,长约5～15 cm。叶互生无柄狭窄、全缘或有疏齿、呈披针形或条长形。全株可入药,味甘,性平,归心经、肺经、小肠经。主要含有酚类、生物碱、脂肪酸类、黄酮类和氨基酸等化学成分,具有清热解毒、消炎止痛、利尿消肿、增强免疫力等功效[7-12]。 李家伟等[13]研究发现,半边莲醇提物及其氯仿萃取物均表现出较好的抗H9N2亚型禽流感病毒的作用,并且发现半边莲中的生物碱和黄酮类很可能是其抗病毒活性成分。秦枫等[14]研究发现半边莲提取物在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒具有阻断、抑制和杀灭的作用。

薄层色谱法(TLC)系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上,成一均匀薄层。待点样、展开后,根据比移值(Rf)与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值(Rf)作对比,用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法,薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术[15]。

由于中国药典“二丁颗粒”质量标准[6]中没有制定半边莲的检出方法。为了能更好的控制本品的质量,从样品前处理、展开剂、检视方法、薄层板及点样量等方面进行了系统的研究,建立二丁提取散半边莲的薄层鉴别方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品 半边莲对照药材(批号121142-201605),中国食品药品检定研究院产品;二丁提取散(批号20200901、20200902、20200903,规格:每1 g相当于原药材1 g),青岛动保国家工程技术研究中心有限公司药物研发实验室产品。

1.1.2 主要试剂 无水甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷,天津市富宇精细化工有限公司产品;石油醚(60～90 ℃),天津市科密欧化学试剂有限公司产品;丙酮,莱阳市康德化工有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 多功能暗箱式紫外分析仪,北京赛百奥科技有限公司产品;双频超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品处理方法的选择 处理方法(1):参考药典半边莲药材的处理方法[6],取本品5 g,加甲醇50 mL,超声处理30 min,放冷,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液(1)。另取半边莲对照药材1 g,同法制成对照药材溶液(1)。

处理方法(2):根据制剂的提取制备方式及半边莲中的化学成分[16],取本品5 g,加水30 mL振摇溶解,加乙酸乙酯萃取2次,每次50 mL,合并乙酸乙酯层,浓缩至干,加乙酸乙酯1 mL溶解,即得供试品溶液(2)。另取半边莲对照药材1 g,加水30 mL回流提取60 min,滤过,滤液冷却后,同法制成对照药材溶液(2)。

取上述处理方法(1)(2)得到的供试品溶液和对照品溶液各2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.2 展开剂的选择 供试品溶液的制备:取本品5 g,加水30 mL,搅拌溶解,加乙酸乙酯萃取2次,每次30 mL,合并乙酸乙酯层,浓缩至干,加乙酸乙酯1 mL溶解,即得供试品溶液。3个批次的二丁提取散,分别按照供试品溶液的制备方法制备,得到供试品溶液1、供试品溶液2、供试品溶液3。

对照药材溶液的制备:另取半边莲对照药材1 g,加水30 mL回流提取60 min,滤过,滤液冷却后同法制成对照药材溶液。

半边莲阴性样品的制备:按照二丁提取散的制备方法制备没有半边莲的阴性样品,按照上述供试品溶液的制备方法,取本品5 g,加水30 mL搅拌溶解,加乙酸乙酯萃取2次,每次30 mL,合并乙酸乙酯层,浓缩至干,加乙酸乙酯1 mL溶解,即得半边莲阴性样品溶液。

取上述供试品溶液、半边莲对照药材溶液、半边莲阴性样品溶液各2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,参考药典半边莲药材及相关文献分别采用以下3种展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。

展开剂(1):石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)[17]

展开剂(2):二氯甲烷-甲醇(9∶1)

展开剂(3):石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(1∶1)

1.2.3 检视方法的选择 为了确定本品的检视方法,取上述供试品溶液、半边莲对照药材溶液、半边莲阴性样品溶液各2 μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,采用不同的检视方法,如下:

检视方法(1):置紫外光灯(365 nm)下检视[17]。

检视方法(2):喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰。

检视方法(3):喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.4 薄层板的选择 取上述供试品溶液、半边莲对照药材溶液、半边莲阴性样品溶液各2 μL,分别点于同一薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视,得到如下的薄层色谱图。

为了考察本品半边莲检出方法的薄层板耐用性,分别采用硅胶G板、硅胶H板、硅胶GF254板[18]薄层板。

1.2.5 点样量的选择 为了考查本品半边莲检出时的点样量,对点样量进行考察。

取上述半边莲阴性样品溶液和对照品溶液各2 μL,上述供试品溶液1分别点样1、2、4 μL于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.2.6 方法稳定性考察

(1)不同厂家薄层板:为了考察本方法对不同厂家/批号薄层板的耐用性,分别采用青岛海化化工(批号181206和批号210318)两个批次的硅胶G板和青岛中科宏远科技(20180606)的硅胶G板按照前面确定的方法进行二丁提取散半边莲的检出。比较不同批号/厂家薄层板的展开效果。

(2)不同环境温度:为了考察不同环境温度对本方法展开效果的影响,分别在室温约25 ℃及冰箱4 ℃两个温度条件下进行本品的半边莲的检出。将上述供试品溶液、半边莲对照药材溶液、半边莲阴性样品溶液点于硅胶板上之后,置于含有展开剂的封闭展开缸中,将展开缸放于不同的环境湿度下,待完成后,分别取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。比较不同环境温度下的展开效果。

(3)不同环境湿度:为了考察不同环境湿度对本方法展开效果的影响,采用干燥器(加变色硅胶)得到低湿环境,经测湿度约为20%;采用干燥器(加饱和NaCl溶液)得到高湿环境,经测湿度约为75%;另湿度50%在实验室得到。将上述供试品溶液、半边莲对照药材溶液、半边莲阴性样品溶液点于硅胶板上之后,置于含有展开剂的封闭展开缸中,将展开缸放于不同的环境湿度下,待完成后,分别取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视。比较不同环境湿度下的展开效果。

2 结果

2.1 样品处理方法结果

2种处理方法得到的供试品溶液及对照药材溶液薄层展开图见图1。从图1的薄层色谱图可以看出,采用处理方法(2)在供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点。采用方法(1)处理在供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,没有显相同颜色和数量荧光斑点。

A.半边莲对照药材溶液(1);B.二丁提取散供试品溶液(1);C.半边莲对照药材溶液(2);D.二丁提取散供试品溶液(2)

综上可知,选择处理方法(2)作为本品薄层鉴别的前处理方法,即取本品5 g,加水30 mL振摇溶解,加乙酸乙酯萃取2次,每次50 mL,合并乙酸乙酯层,浓缩至干,加乙酸乙酯1 mL溶解,即得供试品溶液。另取半边莲对照药材1 g,加水30 mL回流提取60 min,滤过,滤液冷却后,同法制成对照药材溶液。

2.2 展开剂的选择结果

采用不同展开剂得到如下的薄层色谱图(图2)。

A.供试品溶液1;B.半边莲对照药材溶液;C.供试品溶液2;D.半边莲阴性样品;E.供试品溶液3

从薄层色谱图结果可以看出,以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)为展开剂,薄层色谱斑点清晰,迁移值(Rf)较合适,且斑点分离度较好,阴性无干扰,方法的专属性好,因此选择石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)作为本品半边莲薄层鉴别方法的展开剂。

2.3 检视方法的选择结果

采用不同的检视方法得到如下薄层色谱图(图3)。

A.供试品溶液1;B.半边莲对照药材溶液;C.供试品溶液2;D.半边莲阴性;E.供试品溶液

从结果可以看出,采用检视方法(1)即直接置紫外光灯(365 nm)下检视,方法简单,且薄层色谱图斑点显色清晰,因此选择直接置紫外光灯(365 nm)下检视作为本品半边莲检出的检视方法。

2.4 薄层板的选择结果

采用不同薄层板进行薄层色谱鉴别,得到如下的薄层色谱图(图4)。

A.供试品溶液1;B.半边莲对照药材溶液;C.供试品溶液2;D.半边莲阴性;E.供试品溶液3

从薄层色谱结果可以看出,本方法的薄层板耐用性较好,不同的薄层板均能得到较好的薄层色谱图。选择最常规的硅胶G板作为本品半边莲检出用薄层板。

2.5 点样量的选择结果

分别点样1 、2、4 μL于同一硅胶G薄层板上,得到如下色谱图(图5)。

A.半边莲阴性样品;B.半边莲对照药材溶液;C.点样1 μL;D.点样2 μL;E.点样4 μL

从结果可以看出,半边莲阴性样品在半边莲对照药材斑点处无斑点,即半边莲阴性样品对半边莲药材的检出无影响,方法专属性较好。本品点样量1 μL 、2 μL较合适,在供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光主斑点。因此,将点样量定为1～2 μL。

2.6 方法的稳定性结果

(1)薄层板耐用性:用不同的厂家/批号的硅胶G板进行本品的薄层鉴别,得到薄层色谱图如下(图6)。从图6中可以看出,用不同的厂家/批号的硅胶G板进行本品的薄层鉴别,均可以成功的进行本品半边莲的检出,且阴性无干扰。表明,方法对薄层板的耐用性较好。

A.供试品溶液1;B.半边莲对照药材溶液;C.供试溶液2;D.半边莲阴性;E.供试品溶液3

(2)对环境温度稳定性:不同温度条件下得到的薄层色谱图如图7。

A.供试品溶液1;B.半边莲对照药材溶液;C.供试品溶液2;D.半边莲阴性;E.供试品溶液3

从图7中可以看出,不同环境温度下,半边莲的检出色谱图基本一致,均可以成功的进行本品半边莲的检出,阴性无干扰,表明本方法对环境温度的耐用性较好。

(3)对环境湿度稳定性:在不同湿度条件下得到如下所示薄层色谱图(图8)。

A.供试品溶液1;B.半边莲对照药材溶液;C.供试品溶液2;D.半边莲阴性;E.供试品溶液3

从图8可以看出,不同湿度条件下,半边莲的检出色谱图基本一致,均可以成功的进行本品半边莲的检出,阴性无干扰,表明方法对环境湿度的耐用性较好。

2.7 方法的确证

通过供试品溶液制备方法、薄层色谱条件(不同薄层板、展开剂、不同点样量、检视方法等)优化,方法耐用性考察等得到本品的半边莲的检出方法,如下。

取本品5 g,加水30 mL,搅拌溶解,加乙酸乙酯萃取2次,每次30 mL,合并乙酸乙酯层浓缩至干,加乙酸乙酯1 mL溶解,即得供试品溶液。另取半边莲对照药材1 g,加水30 mL回流提取60 min,放冷滤过,同法制得对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,取上述供试品溶液和对照品溶液各1～2 μL,点于同一硅胶G薄层板上,以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(2∶1)展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365 nm)下检视,供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点,所以试验所建立的方法是可行的。

3 讨论

薄层鉴别方法的建立主要包括:样品前处理、薄层色谱条件的选择、优化及方法的耐用性考察等。

中药复方制剂的薄层鉴别方法前处理方法非常重要,需要参考制剂的制备过程来制定,不能仅参考药材的鉴别方法。比如,同样的药材,采用不同的提取溶剂(水、乙醇)制备得到的制剂,其薄层鉴别方法也可能是不一样的。同时,除了参考制剂的制备过程,还需要结合被检出药材的化学成分,必要的话选择合适的溶剂对干扰物进行除杂,对待检出成分进行提取及富集。

二丁提取散是经水提取制备而成,参考半边莲药材的鉴别方法,加甲醇提取,再进行薄层色谱分析,在供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,未能显相同颜色和数量荧光斑点。采用文中第二种前处理方法,制剂加水充分溶解后,加乙酸乙酯萃取,可以去除制剂含有的大量辅料及多糖、果胶等杂质,且乙酸乙酯沸点低,容易进行富集及点样。结果证明,在供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,且方法易于操作,成功率高。在以往含半边莲的单方或复方中药制剂中,这种处理方法尚属首次。

在薄层色谱条件的选择优化中,主要比较了不同展开剂的展开效果、不同的检视方法、不同的薄层板及点样量等。最终确定了最佳的薄层鉴别条件,并从不同厂家/批次的薄层板、不同的环境温、湿度等方面对本品半边莲的检出方法的耐用性进行了研究,结果表明换用不同的薄层板,不同的温湿度环境,半边莲的检出均未受影响,表明方法的稳定性较好。

建立的二丁提取散中半边莲的检出薄层色谱法,专属性强、稳定性好,可以更好的控制本品的质量,为本品的应用推广奠定基础。

本方法的建立为中药复方制剂的定性鉴别尤其是含有半边莲的中药复方制剂的定性鉴别提供参考。