齐帕特罗残留检测酶联免疫吸附试验方法的建立及优化

郭东光,邱骏峰,张凯波,陈明艳,卞爽丽,李文明,崔龙威,孙国鹏,李 鹏,朱艳平,岳 锋,王选年

(新乡学院生物工程学院/动物疫病分子诊断河南省工程实验室,河南新乡 453000)

齐帕特罗(zilpaterol,ZIL)是β-受体激动剂的一种,其分子式为C14H19N3O2,相对分子质量为261.325 u,熔点为123～126 ℃,外观呈白色或类白色结晶性粉末[1]。与盐酸克仑特罗(clenbuterol hydrochloride,CLB)、莱克多巴胺(ractopamine,RAC)和沙丁胺醇(salbutamol,SAL)等一样同属于“瘦肉精”类,其主要作用是促进蛋白质合成和肌肉生长,减少脂肪组织的沉淀[2]。当作为饲料添加剂饲喂动物后能明显增加动物的肌肉/脂肪比,显著提高饲养动物胴体瘦肉率和饲料转化率,明显改善肉的品质和降低动物的养殖成本[3]。但过量的ZIL被动物摄入机体后,其可残留于肌肉、肝脏、脏等组织器官,出现相应的中毒症状[4]。

虽然中国、俄罗斯、欧盟等的122个国家禁止在任何动物源性食品中使用该类药物[5]。但ZIL污染事件仍时有发生[4,6]。目前,ZIL的检测方法主要以仪器分析为主[4,7-10],虽然仪器分析方法能够对不同样品中ZIL做到精确的定性和定量检测,但因仪器价格昂贵、耗时、耗力,并且需配备专用的实验室和操作人员,以及冗长而严格的样品处理程序,使得这种检测方法的广泛使用受到了很大限制。在快速和高通量筛查方面,免疫学检测技术具有灵敏度高、高通量、重现时间快等优点,已被广泛使用[11]。

因此,本研究在前期获得高特异性和高灵敏度抗体的基础上建立了检测ZIL残留物的间接竞争酶联免疫吸附试验(indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)方法,为后续开发ZIL快速检测试剂盒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 新西兰大白兔,体重约1.5 kg,由新乡学院动物疫病分子诊断河南省工程实验室提供。

1.1.2 主要试剂 齐帕特罗(zilpaterol,ZIL)、盐酸克仑特罗(clenbuterol hydrochloride,CLB)、特布他林(terbutaline,TBL)、盐酸多巴胺(3-hydroxytyramine hydrochloride,DH)(纯度>99%),德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司产品;莱克多巴胺(ractopamine,RAC)、沙丁胺醇(salbutamol,SAL)、溴布特罗(brombuterol,BRO)、西马特罗(cimaterol,CIM)、班布特罗(bambuterol,BAM)、达氟沙星(danofloxain,DAN)、泰乐菌素(tylosin,TYL,纯度>98%),德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司产品;牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)和鸡卵清白蛋白(ovalbumin,OVA,纯度>98%),德国Sigma公司产品;弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant,FCA)、弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant,FIA)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 (1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide),德国Sigma公司产品;HRP-羊抗兔IgG,北京索莱宝生物科技有限公司产品;吗啉乙磺酸(monohydrate,MES)、4-溴丁酸乙酯、无水碳酸钾、丙酮、乙酸乙酯(分析纯),上海有朋化工有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 Enspire多功能酶标仪和Mini-PROTEAN Tetra Cell 1658001蛋白电泳仪,美国Bio-Rad公司产品;QP50质谱仪和LC-20A高效液相色谱仪,日本岛津公司产品;RV10 digitalV旋转蒸发仪和CMAGHS4加热磁力搅拌器,德国IKA公司产品;UV-3010紫外可见分光光度计,日本Hitachi公司产品。

1.2 方法

1.2.1 齐帕特罗完全抗原的合成和多克隆抗体的制备及鉴定 参照前期已发表文章进行[12],将1 g ZIL盐酸盐添加到20 mL的NaOH溶液中(pH>10),经与4-溴丁酸乙酯反应后,将酯转化为游离酸。然后,加50 mg EDC和20 mg NHS,室温搅拌反应2 h后分别再与20 mg BSA和20 mg OVA室温搅拌2 h。透析后,分别用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和紫外扫描(ultraviolet scanning,UV)鉴定。然后,选择健康的新西兰大白兔2只,体重约1.5 kg,将合成的完全抗原进行免疫,剂量为500 μg,1 mL/只,每隔20 d免疫1次,共5次。最后1次免疫后10 d,耳缘静脉取血2 mL,抽取血清,采用间接酶联吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)评估免疫后的血清效价。采用间接竞争ELISA评估多抗血清的半数抑制浓度(half-inhibitory concentration,IC50)和抗体的特异性。

1.2.2 抗原最佳包被浓度的确定 将ZIL-OVA(ZIL-OVA,2 μg/mL-60 ng/mL)包被至96孔ELISA平板(100 μL/孔),37 ℃孵育2 h,或者4 ℃ 孵育过夜,PBST清洗3次;用5%脱脂奶粉+PBST,200 μL/孔封闭酶标板,PBST清洗板3次后吸干;将抗ZIL血清(1∶400至1∶12 800, 1 mg/mL OVA/PBST稀释),100μL/孔,37 ℃作用1.5 h,用PBST清洗板3次,然后吸干;用1 mg/mL OVA/PBST液稀释HRP标记羊抗兔(1∶5 000),100 μL/孔,37 ℃下孵育1 h。用PBST清洗板3次,然后吸干;100μL/孔显色液(TMB单组分显色液),37 ℃避光反应 15 min;通过添加50 μL/孔的2 mol/L硫酸停止显色,立即在450 nm下进行读数并记录结果。根据间接竞争ELISA检测方法的要求,选择OD 450 nm值在1.2～1.5之间且抗原、抗体用量较少的浓度作为最佳工作浓度。

1.2.3 一抗最佳稀释比例的确定 以上述确定的抗原最佳包被浓度进行包板检测,其他条件不变,确定一抗稀释最佳比例。根据ic-ELISA检测方法的要求,选择OD 450 nm值在1.2～1.5之间且抗原、抗体用量较少的浓度作为最佳工作浓度。

1.2.4 标准曲线的建立 以上述得到的最佳条件为基础,采用ic-ELISA评估检测方法IC50,计算检测范围(IC20～IC80)及最低检测限(LOD ,IC10)。以IC20～IC80之间质量浓度作为该测定方法的线性范围,以IC10对应的质量浓度为检出限。基本步骤参考前期已发表文章进行[12]。最后,使用Origin 9.0软件中的四参数拟合函数对数据进行拟合,以标准品浓度的对数值为横坐标,以吸光值B/B0作为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5 pH、盐、溶剂和基质效应的影响 根据上述已确定条件,分别鉴定检测体系中pH、盐(NaCl)、溶剂(甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和DMSO)和检测基质(牛尿液)对检测灵敏度的影响,并以此确定反应条件的最佳pH、盐浓度、溶剂百分比和基质浓度。

1.2.5.1 pH对IC50的影响 将ZIL标准品在1 mg/mL OVA/PBST中稀释,分别在pH为5、5.6、6.2、6.8、7.4、8.0和8.6下进行IC50测定,以最低IC50值对应的pH为最佳反应pH。

1.2.5.2 盐浓度对IC50的影响 为分析盐浓度对分析性能的影响,将ZIL标准品稀释在1 mg/mL OVA/10 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中,并添加NaCL,使其浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L,并分别在每个浓度下进行IC50测定和Amax(B0)值的测定,判断盐浓度对IC50的影响。

1.2.5.3 溶剂对IC50的影响 为分析不同溶剂对分析性能的影响,将组织提取溶剂,甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和DMSO稀释在1 mg/mL OVA/PBST中,分别得到0、2.5%、5%、10%、15%、20%和30%(V/V)溶剂,建立各溶剂浓度的校正曲线,并在每个条件下测定IC50和Amax(B0)值,相比于对照组,以相应溶剂体积百分比引起IC50变化不超过10%为判断标准,其对应的溶剂体积即为最大溶剂百分比。

1.2.5.4 检测基质对检测方法灵敏度的影响 用1 mg/mL OVA/PBST稀释牛尿液(1∶2、1∶3、1∶5、1∶10、1∶20和1∶40),将ZIL在1 mg/mL OVA/PBST中的标准曲线分别与在稀释的牛尿中制备的标准曲线进行IC50和B0值比较,确定基质最佳稀释浓度。

1.2.6 特异性检测 基本步骤同1.2.4所述,将10种标准品SAL、TBL、BRO、CIM、CLB、BAM、DH、RAC、DAN、TYL,按500、50、5、0.5、0.05、0 ng/mL稀释至含有1 mg/mL OVA/PBST)中,各吸取50 μL/孔至相应孔中,然后按50 μL/孔添加兔血清。2 mol/L硫酸停止显色,450 nm处读取OD值。根据交叉反应率(CR)100%=IC50(ZIL)/IC50(竞争物)×100%,求出各个小分子的IC50,鉴定检测方法的特异性。

1.2.7 批间和批内变异试验 将ZIL标准品浓度0.2、0.5、1、2、4、8、10 ng/mL分别用上述确定的最佳稀释比例的尿液稀释至所需浓度。尿液样本中ZIL浓度通过标准曲线500、250、50、25、5、2.5、0.5、0.25、0 ng/mL计算,每一浓度测定6个重复,用以确定批内试验变异情况。为测定批间试验变异的差异,每天测定每个样品中ZIL浓度,连续测6 d,统计数据,分析结果。

1.2.8 仪器方法确证 应用HPLC-MS对所建立的间接竞争ELSISA进行验证,采用HPLC-MS和ic-ELISA检测方法同时对“1.2.7”所处理的0.2、0.5、1、2 ng/mL,共24个样品进行测定,每个加标样品设置6个重复,分别以ic-ELISA检测方法为横坐标和 HPLC-MS所测浓度为纵坐标,应用Origin 9.0软件拟合回归方程,计算两种方法检测结果的相关系数。

2 结果

2.1 抗原最佳包被浓度的确定

由方阵滴定试验结果可知(表1),当包被源ZIL-OVA为2 μg/mL时,其OD 450 nm为1.427,其抗体用量较少且OD 450 nm值最接近所要求的测定范围,因此选择2 μg/mL作为抗原最佳工作浓度。

表1 抗原最佳包被浓度的确定

2.2 一抗最佳稀释比例的确定

以上述筛选到的抗原最佳包被浓度包板,由第二次棋盘法试验结果可知(表2),当血清稀释度为1∶6 400时,其OD 450 nm为1.396,进一步确定血清的最佳稀释度为1∶6 400为最佳反应条件。

表2 血清最佳稀释度和二抗最佳稀释度的确定

2.3 标准曲线的建立

为鉴定检测方法的灵敏度,如图1所示,间接竞争法ELISA检测结果显示,所建立的标准曲线拟合度良好,相关系数(R2)为0.999 2。回归方程为y=A2+(A1-A2)/(1+(x/x0)p),根据绘制的标准曲线计算出IC50值为0.317 ng/mL,线性检测范围(IC20～IC80)为0.136～1.181 ng/mL,最低检测限(LOD,IC10)为0.081 ng/mL。

图1 间接竞争ELISA标准曲线

2.4 pH、盐、溶剂和基质效应的影响

2.4.1 pH和盐浓度对IC50的影响 如图2所示,从试验结果可知,当pH为7.4时,IC50值最低,为0.328 ng/mL,同时Amax(B0)值在所规定的范围之内,其OD 450 nm值为1.497,且Amax/IC50值最大。因此,该检测方法最佳pH为7.4。

图2 pH和盐浓度对检测灵敏度的影响

以确定的最佳pH为反应条件,如图2所示,通过分析检测体系中NaCl对反应条件的影响,发现0、0.05、0.1、0.2、0.4 mol/L盐浓度的IC50平均值分别为0.301、0.312、0.305、0.328、0.330 ng/mL,IC50值变化均在10%以内,当NaCl浓度提升至0.8和1.6 mol/L时,其IC50值明显增加,分别为0.438和0.706 ng/mL。因此,当检测体系中盐浓度≤0.4 mol/L时,可以得到较高的检测灵敏度。

2.4.2 溶剂和检测基质对IC50的影响 为鉴定组织不同提取溶剂对检测灵敏度的影响,在已优化条件的基础上分别检测了丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和DMSO对检测性能的影响。与对照组相比,以溶剂浓度含量引起IC50变化不超过10%为检测灵敏度所能承受的最大溶剂浓度。如图3所示,当甲醇、乙醇、丙酮和DMSO的含量为5%时,IC50值分别提高了4.4%、3.3%、6.7%和6.5%;当甲醇、乙醇和丙酮的含量为10%时,IC50值分别提高了23.1%、43.6%、40.9%和21.8%;当乙腈含量为10%时,IC50值提高了2.6%;当乙腈含量为15%时,IC50值提高了18.3%;虽然Amax(B0)和Amax(B0)/IC50会随给定溶剂百分比的增加均呈线性下降趋势。当甲醇、乙醇、丙酮和和DMSO的含量低于5%时,乙腈含量低于10%时能获得较高的检测灵敏度。

图3 溶剂和检测基质对检测灵敏度的影响

为评估检测基质(尿液)含量对检测灵敏度的影响,由结果可知(图3),相比于对照组,当牛尿液浓度占比为5%、10%、15%、20%、30%、40%时,其IC50值为0.352、0.389、0.402、0.878、1.576、2.24 ng/mL。当浓度提高至20%时,其IC50值为0.878 ng/mL,约是对照组的3倍。由结果可知,Amax(B0)和Amax(B0)/IC50会随尿液浓度百分比的增加均呈下降趋势。

2.5 方法的特异性测定

为进一步鉴定检测方法的特异性,如表3所示,应用所建立的ic-ELISA方法通过检测10种小分子的IC50结果表明,其IC50值均高于1 000 ng/mL,说明该方法具有良好的特异性。

表3 交叉反应检测结果

2.6 稳定性试验

如表4所示,为进一步鉴定所建立ic-ELISA检测方法的稳定性,批间和批内试验检测结果表明,相比于目标值,回收率误差几乎都在10%以内,牛尿液样品中批内和批间添加回收率分别为101%～112%和101%～120%,且变异系数均小于10%,表明所建立的检测方法具有良好的稳定性。

表4 检测方法的稳定性检测结果

2.7 仪器方法对比

为进一步验证所建立方法的准确性,采用本方法和HPLC-MS同时对24份加标样品(0.2、0.5、1、2 ng/mL)进行测定。如图4 所示,以建立的ic-ELISA检测方法的测定值为横坐标,HPLC-MS的测定值为纵坐标,拟合回归方程:y=a+b×x,R2=0.990 6,进一步表明所建立ic-ELISA检测方法可用于实际样品中ZIL的检测。

图4 ic-ELISA与HPLC-MS方法对比

3 讨论

基于抗原与抗体特异性结合原理的ELISA检测技术被认为是残留分析简便、最为高效的方法之一[13-14]。因ic-ELISA具有信号放大作用,背景值较低,检测的线性范围宽和灵敏度高等优点[15-16],是小分子物质的残留检测主要方法[17]。然而,在检测过程中,其检测灵敏度会受到体系中各种因素的影响,因此本试验评估了检测体系中pH、盐浓度、丙酮、甲醇、乙醇、乙腈、DMSO和检测基质的影响。此外,在优化反应条件时,本研究综合考虑了最大吸光值Amax(B0),IC50及两者之间的比例(Amax/IC50)来确定最佳作用条件,以IC50越低,Amax/IC50较大对应的反应条件为最佳条件[18]。

通过分析pH对检测方法灵敏度的影响发现,当pH大于或小于7.4时,均出现IC50明显升高的趋势,Amax(B0)值的变化也呈现相同的变化趋势,呈抛物线形变化。检测结果表明,在pH 7.4的中等浓度缓冲液中进行分析时,分析性能可进一步优化,可得到一个较小的IC50和一个可接受的B0值。此外,pH对检测灵敏度的影响间接反映了ZIL和抗体之间的离子相互作用是结合的关键[19]。

盐浓度也是影响ic-ELISA检测灵敏度的一个重要因素[6]。由试验结果可知,当检测体系中的NaCl逐级增加至0.4 mol/L时,测定介质中对IC50影响不大,IC50值变化均在10%以内,说明抗体相对于检测体系中盐浓度的影响相对稳定。然而,当盐浓度提升至0.8 mol/L和1.6 mol/L时,其IC50明显增加,分别为0.438、0.706 ng/mL。因此,在测定过程中,如果盐浓度维持在0.4 mol/L附近,可得到较高的检测灵敏度。

丙酮、甲醇、乙醇、乙腈和DMSO常用于从组织和排泄物中提取待分析物[19-20]。因此,本研究测试了其对ic-ELISA分析性能的影响。由结果可知,5种溶剂对IC50和Amax(B0)几乎呈现相同变化趋势,随着溶剂浓度的增加,IC50逐渐升高,Amax(B0)逐渐下降。因此,为获得较高的灵敏度,应尽量减低检测体系中相应溶剂的存在比例。在本研究中,当检测体系中甲醇、乙醇、丙酮和DMSO的含量≤5%,乙腈含量≤10%时,可得到较高的检测灵敏度。

尿液是“瘦肉精”残留检测中常用的检测基质,也是用于活体动物筛选的主要对象[21-22],因此本研究选择牛尿液作为评估IC50基质效应的主要依据。由结果可知,随着检测体系中尿液浓度的升高,IC50明显增加。因此,为降低基质效应的影响,需要评估检测体系中最大基质(尿液)含量。由结果可知,当尿液浓度为15%时,虽然相比于对照组其IC50提高了32.67%,但是IC50仅提高了0.099 ng/mL。当尿液浓度提高至20%时,其IC50升高至0.878 ng/mL。因此检测体系尿液的含量以不超过15%时,可以得到较高的检测灵敏度。

此外,与本研究所建立的ic-ELISA相比,Shelver W L等[19]也通过将ZIL与4-溴丁酸乙酯反应,与载体蛋白反应后制备了完全抗原,免疫山羊后获得了特异性的多抗血清,建立了检测ZIL的ic- ELISA检测方法,相比于本研究所建立的检测方法,其IC50相对较高,约为3.94 ng/mL,LOD也较高,为0.4 ng/mL。其还以制备的完全抗原ZIL-KLH免疫小鼠后,以获得的单克隆抗体为基础建立了检测ZIL ic-ELISA检测方法,其IC50约为0.310 ng/mL[20],与本研究所建立的检测方法的灵敏度相当。因此,本研究所建立的检测方法具有较高的灵敏度。

为进一步鉴定所建立的ic-ELISA的准确度,经与HPLC-MS检测方法相比,所建立检测方法检测结果与HPLC-MS检测结果的线性回归方程为y=a+b×x,R2=0.990 6。说明该检测方法与HPLC-MS具有相同的检测能力,同时极大的提高了检测速度和通量,为动物源性食品中ZIL的快速检测提供了有效的手段。

本研究成功建立了检测ZIL药物残留的ic-ELISA检测方法,该方法灵敏度高、特异性强、准确度好、检测限低,为进一步研制ZIL免疫快速检测试剂盒奠定了基础。