1株黑天鹅源H5N8亚型禽流感病毒遗传演化分析

栗云鹏,刘海莹,张启龙,刘晓冬,周德刚,张 跃,傅彩霞

(北京市动物疫病预防控制中心,北京 102629)

禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的以感染禽类为主的一种传染病。AIV分为高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Lowly pathogenic avian influenza virus,LPAIV)。LPAIV通过血凝素蛋白裂解位点的改变产生HPAIV[1]。HPAIV包括H5和H7亚型的部分禽流感毒株,这些毒株不仅对家禽的生产造成严重危害,也对人类的健康构成威胁。自2014年1月韩国[2]暴发H5N8亚型HPAIV开始,随后在德国、俄罗斯、意大利、英国等欧洲国家以及美洲国家也引起流行[3-5]。2020年起,我国新疆、四川、湖南、山西等地陆续发生H5亚型HPAIV疫情,而这些疫情多是由野禽感染引起。有研究表明,人类和家禽感染的AIV或者其部分基因可能来自野禽[6]。2021年2月1日,北京市海淀区圆明园遗址公园发生野生天鹅H5N8亚型高致病性禽流感疫情,疫点共栖息野禽15只,发病3只,死亡3只。本研究对引起该疫情的H5N8亚型禽流感病毒株进行全基因组测序及遗传进化特征分析,为进一步研究H5N8亚型进化规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 样品为2021年2月1日北京圆明园遗址公园送检的黑天鹅肺脏、肝脏组织。

1.1.2 主要试剂 病毒核酸提取试剂盒,Tiagen公司产品; DNA纯化回收试剂盒、质粒提取/纯化试剂盒,Promega公司产品;禽流感荧光RT-PCR试剂盒,哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品;DNA标准,Omega公司产品;pXT19-T载体,北京鼎国昌盛生物科技有限责任公司产品。

1.1.3 主要仪器 荧光PCR仪(QuantStudio 7)、PCR仪(SimpliAmp),美国ABI公司产品;凝胶成像分析系统(GelDoc XR),美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及荧光RT-PCR鉴定 用病毒核酸提取试剂盒,按照说明书提取黑天鹅肺脏及肝脏组织总RNA。用禽流感病毒荧光RT-PCR试剂盒,按照说明书进行荧光RT-PCR反应。

1.2.2 全基因组扩增 根据荧光RT-PCR的初步鉴定结果,参照文献[7]H5N8亚型HPAIV全基因组引物扩增序列(表1),利用一步法RT-PCR进行核酸扩增。RT-PCR反应体系(50 μL)为:2×RT-PCR buffer 25.0 μL,10 μmol/L上、下游引物各2.0 μL,AMV 1.0 μL,ddH2O 12.0 μL,RNA模板8.0 μL。反应程序为:45 ℃反转录45 min;94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 3 min,共35个循环;72 ℃ 7 min。

1.2.3 PCR产物基因测序 将1.2.2的PCR产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带并进行DNA回收纯化。将纯化后的PCR产物连接到pXT19-T载体,转化大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞,筛选并提取阳性质粒,送生工生物工程(上海)有限公司进行测序。

1.2.4 全基因组序列分析 应用DNA Star分析软件,将测序完成得到的8个基因序列与GenBank中公布的H5N8亚型HPAIV的相应基因序列进行同源性比较和分析。用MEGA 11软件构建其HA、NA基因系统进化树,进行遗传演化分析。

2 结果

2.1 病毒鉴定及全基因组扩增结果

以组织总RNA为模板,进行荧光RT-PCR反应,初步鉴定该毒株为H5N8亚型禽流感病毒,利用表1中特异性引物进行全基因组序列RT-PCR扩增,扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,得到的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、MP、NS基因扩增片段长度分别是2 345、2 345、2 236、1 788、1 569、1 469、1 027、894 bp,与预期结果相符(图1)。

M.DNA标准DL 1 500;1.PB2基因;2.PB1基因;3.PA基因;4.HA基因;5.NP基因;6.NA基因;7.MP基因;8.NS基因

分别将8个基因片段的RT-PCR扩增产物连接到pXT19-T载体后进行克隆测序鉴定,并与GenBank中已公布的AIV序列进行Blast比对,确定引发此次黑天鹅禽流感疫情的为H5N8亚型禽流感病毒,并将该毒株命名为A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)。

2.2 全基因组序列同源性分析结果

对本研究获得的黑天鹅源A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)鉴定株的全基因组序列进行同源性分析,结果显示,本研究鉴定的H5N8毒株的HA基因与70株来自世界不同地区的H5N8亚型禽流感病毒的HA基因之间的核苷酸同源性为93.5%～99.9%,其中与2014-2019年世界不同地区H5N8分离株的核苷酸同源性为93.5%～99.0%,与2020-2021年野鸟源中国H5N8分离株的核苷酸同源性高达99.1%～99.9%,与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、柬埔寨、尼日利亚、法国、俄罗斯和日本部分H5N8毒株密切相关,同源性为98.7%～99.5%,与2020-2021年日本大部分H5N8毒株的同源性较低,仅为93.6%～95.9%。本研究鉴定的H5N8毒株的NA基因与74株来自世界不同地区的H5N8亚型禽流感病毒的NA基因之间的核苷酸同源性为93.5%～99.5%,其中与2020-2021年野鸟源中国分离株的核苷酸同源性为98.9%～99.5%,与2020-2021年哈萨克斯坦、柬埔寨、尼日利亚、法国和日本部分H5N8毒株的NA基因同源性较高,为98.5%～99.4%。

应用NCBI的Blast检索相似毒株,分析表明,本研究的H5N8毒株的HA基因核苷酸序列与A/goose/Hebei/HG12/2021(H5N8)的同源性最高,为99.9%。NA基因与A/Cygnuscolumbianus/Hubei/51/2020(H5N8)、A/Chlidoniashybrida/Hubei/55/2020(H5N8)的同源性最高,均为99.5%。PB2基因与A/mallard/Miyazaki/4501C607-c1/2021 (H5N8)的同源性最高,为99.8%。PB1基因与A/Wild bird/China/Cixi02/2020(H5N8)的同源性最高,为99.7%。PA基因与A/Cygnuscolumbianus/Hubei/116/2020(H5N8)的同源性最高,为99.7%。NP基因与A/eurasian coot/Shandong/W6143/2020(H5N8)的同源性最高,为99.7%。MP基因与A/eurasian coot/Shandong/W5611/2020(H5N8)的同源性最高,为99.6%。NS基因与A/goose/Hebei/HG12/2021(H5N8)的同源性最高,为99.7%(表2)。

表2 与A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)各基因核苷酸序列同源性最高的毒株

2.3 遗传进化分析结果

对本研究黑天鹅源 A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)的全基因组序列使用NCBI数据库中的Blast工具进行比对,选择亲缘关系较近的毒株及其他clade代表性毒株序列作为参考序列,采用MEGA 11软件构建HA基因和NA基因遗传进化树,进行遗传演化分析。

HA基因进化树显示,A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)毒株属于Clade 2.3.4.4b进化分支(图2),该鉴定毒株与2020-2021年在中国野生鸟类中传播的2.3.4.4b进化支H5N8亚型HPAIV高度同源。HA基因的系统发育分析显示,2020-2021年流行的2.3.4.4b进化支的H5N8亚型HPAIV进一步分化为两个不同的组群,Group 1和Group 2。本研究的H5N8毒株分布在Group 1,Group 1群还聚集了2020-2021年来自越南、哈萨克斯坦、柬埔寨、尼日利亚、法国、俄罗斯和日本部分的H5N8毒株。Group 2群则聚集了2020-2021年来自日本的大多数H5N8毒株。NA基因进化树显示,本研究的H5N8毒株的NA基因也属于Group 1群(图3)。

图2 H5亚型AIV HA基因遗传进化树(◆为本研究鉴定的毒株)

图3 H5N8亚型AIV NA基因遗传进化树(◆为本研究鉴定的毒株)

2.4 氨基酸位点突变分析结果

HA蛋白裂解位点是否含有多个碱性氨基酸是区分HPAIV和LPAIV的一个重要分子指标。A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)鉴定株的HA基因的关键氨基酸位点分析结果显示,其HA蛋白裂解位点氨基酸序列为REKRRKR↓GLF(“↓”表示裂解位点),含多个连续的碱性氨基酸,符合HPAIV的分子特征。HA蛋白受体结合区域氨基酸位点分析显示,本研究鉴定的H5N8毒株的HA蛋白的226位点为谷氨酰胺(Q),228位点为甘氨酸(G),表明该毒株仍以结合禽类受体(α-2,3唾液酸受体)为主,但其HA蛋白出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,且158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型禽流感病毒对人源唾液酸受体(α-2,6唾液酸受体)的结合能力[8-9]。内部基因氨基酸位点分析发现了多个关键氨基酸位点,PB2蛋白的292V、389R和598T位点,NP蛋白的286A和437T位点,M1蛋白的30D和215A位点,NS1蛋白的42S和106M位点,这些关键氨基酸位点可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性[10-11]。

3 讨论

H5N8亚型禽流感病毒自从2014年在韩国引起大量家禽和野鸟疫情以来,已经传遍亚洲、欧洲、非洲和美洲的多个国家和地区。2018-2019年,全球H5N8亚型禽流感疫情相对平稳,但是从2020年开始,H5N8亚型AIV又在全球范围内掀起新的一波感染潮。自2020年1月至2021年12月,我国公布的15起H5亚型禽流感疫情中,H5N8亚型疫情7起,是引发疫情次数最多的亚型。而这7起H5N8亚型禽流感的宿主均是野禽,野禽迁徙的特性说明它们活动范围广并且具有不确定性,这使得野禽在H5N8亚型禽流感的流行和传播过程中发挥着重要的作用。野禽感染AIV一般呈隐性感染,不表现临床症状,但是会持续向外排毒,加大了野禽迁徙传播HPAIV的风险。北京具有地理优越性,成为候鸟选择的重要栖息地,加之冬季天气寒冷,正是高致病性禽流感高发期,野禽通过迁徙的路线,造成了HPAIV长距离的传播和重组[12],并可传播给家禽,对养禽业造成严重危害。H5亚型AIV具有广泛的感染宿主谱,可以感染多种禽类和哺乳动物,甚至突破种间屏障感染人。2021年俄罗斯报告全球首例人感染clade2.3.4.4分支H5N8亚型AIV的病例,病毒已经跨越种间屏障,从禽类传播到人[13],对人类公共卫生安全的潜在威胁不容忽视。本研究对2021年2月北京市海淀区圆明园遗址公园野生黑天鹅感染的H5N8亚型HPAIV进行全基因组测序、系统发育和氨基酸位点分析,解析了该黑天鹅源H5N8亚型HPAIV的遗传演化特征,为今后更为有效预警防控高致病性禽流感提供科学依据。

AIV属于A型流感病毒,其基因组由8个单股负链RNA片段组成,分别为PB2、PB1、PA、HA、NA、MP、NP和NS[14]。本研究的黑天鹅源A/Wild swan/China/Beijing0201/2021(H5N8)毒株的全基因组序列同源性分析表明,其HA基因与2020-2021年野鸟源中国H5N8分离株的核苷酸同源性高达99.1%～99.9%,NA基因与2020-2021年野鸟源中国分离株的核苷酸同源性为98.9%～99.5%,说明该鉴定株与2020-2021年我国多地区流行的H5N8亚型HPAIV进化关系密切,这些毒株分布范围广,通过候鸟的迁徙实现跨地域的快速传播。分析结果也显示,本研究的鉴定株与2020-2021年越南、哈萨克斯坦、柬埔寨、尼日利亚、法国和俄罗斯等地的H5N8毒株亲缘关系较近,遗传进化关系上聚类在一起,属于同一个亚分支。

AIV具有快速突变的特点,每年每1 000个位点可以累积2～8个替换[15]。由于AIV的高突变率,使得病毒在遗传性、致病性、抗原性、受体结合特性以及跨宿主传播能力等方面发生改变。根据病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)抗原性的不同,AIV被分为18个不同的HA亚型(H1-H18)和11个NA亚型(N1-N11)[16]。HPAIV现已进化出多个遗传分支,以我国首次分离到的A/goose/Guangdong/1/96为代表毒株的亚系分为10个分支,clade 0～clade 9。我国目前流行的H5N8分支为2.3.2.1和2.3.4.4,但是2.3.2.1分支的毒株分离数量迅速下降并且分布区域也大幅减少,而2.3.4.4分支逐渐出现多种NA亚型,成为主要流行毒株。本研究的黑天鹅源H5N8毒株属于Clade2.3.4.4b分支,且具备HPAIV的分子特征。HA蛋白是影响AIV受体结合特异性的关键蛋白,已有多项研究证实,HA蛋白关键位点氨基酸的突变可能导致受体结合能力和特异性的改变。本研究的黑天鹅源H5N8毒株虽然仍以结合禽类受体为主,但其HA蛋白多个位点出现S137A、T160A、T192I、S227R氨基酸突变,并且T160A导致了158位缺失糖基化位点,这些位点的突变均能够增强H5亚型AIV对人源唾液酸受体的结合能力,表现出双受体结合特性,增加了人感染该病毒的风险。内部基因多个关键氨基酸位点发生突变,PB2蛋白的I292V、K389R、V598T,NP蛋白的V286A、M437T,M1蛋白的N30D、T215A,NS1蛋白的P42S、I106M,这些氨基酸位点的突变可以增强流感病毒在哺乳动物体内的复制能力和致病性,增加了病毒跨越种间屏障传播的风险。

野鸟一直被认为是禽流感病毒的天然宿主。野鸟在众多亚型禽流感病毒的传播和变异中发挥着极其重要的作用,从家禽及哺乳动物体内分离到的流感病毒很多直接或间接来源于野鸟。我国湖泊众多,野鸟数量及种类也多,易出现各类迁徙鸟的大规模聚集,增大了禽流感病毒在候鸟之间、候鸟与家禽之间相互传播的可能性。候鸟迁徙是导致禽流感病毒跨洲际传播的主要因素之一,且极易发生基因重配而产生新的毒株,本研究野鸟源H5N8毒株的多个基因关键氨基酸位点突变也显示出H5N8亚型HPAIV在传播过程中有毒力增强的趋势。因此,要持续加强野鸟禽流感病毒的监测及生物学评估,实时掌握病毒的流行动态,为禽流感疫情的综合防控提供早期预警。