基于NGF/TrKA/TRPV1通路探讨电针改善功能性消化不良大鼠胃高敏感性

金舒文 刘伟 刘嘉宝 范建超 韩永丽 周丽 徐派的 张红星

1湖北中医药大学针灸骨伤学院（武汉 430061）；武汉市第一医院2骨科，3针灸科，4康复科（武汉 430030）

功能性消化不良（FD）是常见的功能性胃肠病，内脏高敏感性是引起FD 上腹疼痛的重要病理因素，与餐后饱胀、早饱症状相关［1-2］。越来越多的研究证实肥大细胞激活的神经生长因子（NGF）/原肌球蛋白受体激酶（TrkA）/瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）通路在内脏高敏感性的病理发展中起到至关重要的作用［3-4］。在胃肠道黏膜，聚集于感觉神经末端的肥大细胞脱颗粒，释放NGF，与其受体TrKA 结合后，增强TRPV1 表达并促进其敏化［5］。敏化后的TRPV1 释放多种神经肽如降钙素基因相关肽（CGRP），导致敏感性增高，进而诱发上腹痛、恶心等症状［6］。且在临床研究［7-8］中发现FD 患者相比于健康人胃黏膜肥大细胞数量上升、脱颗粒增加，TRPV1 表达升高。尽管目前已证实电针可显著改善FD大鼠胃高敏感性［9-10］，但尚无研究探讨电针对关键通路NGF/TrkA/TRPV1 在FD 中的作用。因此，本研究旨在观察电针对FD 大鼠胃组织肥大细胞介导的NGF/TrkA/TRPV1 通路的影响，探讨电针改善胃高敏感性的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组由三峡大学实验动物中心购入SPF 级雄性7 d 龄SD 幼鼠30 只，体质量（20 ± 5） g，许可证号：SYKK（鄂）2018-0104。饲养于湖北中医药大学SPF级实验动物房。采用随机数字表法分成空白组、模型组、电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组，每组6 只。实验期间遵循《湖北省实验动物管理条例》，伦理审批号：HUCMS201805001。

1.2 主要仪器和设备主要试剂：NGF 抗体、TrKA抗体及TRPV1 抗体（博奥森），CGRP 酶联免疫吸附试剂盒（建成），碘乙酰胺（阿拉丁试剂），主要仪器设备：韩式穴位神经刺激仪（南京济生医疗科技有限公司），一次性无菌针灸针（吴江市云龙医疗器械有限公司），ProtocolPlusDeluxe9.6R 数据处理分析系统（加拿大G&J Electronics 公司），电泳仪（北京市六一仪器厂），荧光定量PCR 仪（Bio-rad），光学显微镜（奥林巴斯）。

1.3 模型制备采用碘乙酰胺溶液灌胃+不规则饮食+郭氏夹尾刺激法的多因素干预方式造模［10］。用0.1%碘乙酰胺混合液对10 d 龄大鼠灌胃，每次0.2 mL，每天1 次，共6 d；空白组予以2%蔗糖溶液等剂量灌胃。3 周龄时，对造模大鼠隔天喂食；7 周龄时予以郭氏夹尾刺激，每次30 min，每天2 次，2 次间隔4 h 以上，共7 d。以大鼠精神萎靡，毛发干枯，进食量显著减少，大便稀溏等为主要特征，且胃肠组织未发现器质性病变，提示造模成功。

1.4 干预措施电针组：选取双侧足三里穴。0.28 mm × 25 mm 一次性无菌针灸针针刺双侧足三里穴后连接韩式穴位神经刺激仪，频率2 Hz/100 Hz，强度1 mA，每天1 次，每次20 min，连续干预14 d。抑制剂组：予以NGF 抑制剂anti-NGF，浓度1∶2 000，1 mg/kg 腹腔注射，每天1 次，连续干预14 d［11］。电针+抑制剂组：予以抑制剂腹腔注射，30 min 后电针治疗，连续干预14 d。

1.5 取材干预结束后，隔夜禁食，予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔麻醉。剪取部分胃底组织置于-80 ℃冰箱冻存。另取部分胃底组织置于4%多聚甲醛中固定。

1.6 检测指标

1.6.1 一般情况观察并记录大鼠精神状态、活动情况、毛色和大便性状。在基线期、造模后、干预后，对大鼠进行称重，记录大鼠体质量变化。

1.6.2 胃顺应性和高敏感性术前禁食不禁水12 h，麻醉后，将连接聚乙烯管的球囊经食道置入于胃中。待大鼠苏醒后，以20、40、60、80 mmHg 的梯度分阶段增加球囊压力，每次持续30 s，后释放压力至0 mmHg，3 min 后进行下一梯度加压。Protocol Plus Deluxe 9. 6R 系统监测并记录胃内气囊容积，记录大鼠腹壁回撤反应（AWR）评分。气囊内容积/压力表示胃顺应性［12-13］。以各压力阶段大鼠AWR 评分表示胃高敏感性［14-15］。

1.6.3 胃组织病理学将4%多聚甲醛中固定的胃底组织进行梯度脱水，经石蜡包埋、切片、脱蜡后，用苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察胃组织形态。

1.6.4 胃组织肥大细胞数量及脱颗粒用1%甲苯胺蓝溶液染色30 min，冰醋酸分化透明，树胶封固。光镜拍照，400 倍视野下每张切片随机选取3 个部位计数并取平均值。肥大细胞脱颗粒率=肥大细胞脱颗粒数/肥大细胞总数× 100%。

1.6.5 免疫组化法检测胃组织TRPV1 阳性表达取冻存的大鼠胃组织，进行包埋、切片、脱蜡后，进行抗原活化、封闭，孵育一抗、二抗，室温DBA 显色，苏木素复染封片。Image-pro Plus 6.0 图像分析系统分析平均光密度值。

1.6.6 蛋白免疫印迹法检测胃组织NGF、TrkA、TRPV1 蛋白表达提取总蛋白，测定浓度。电泳、转膜后加入一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，清洗3 次，加入二抗（1∶1 500）孵育30 min，清洗4 次，ECL 发光法显色，软件分析条带吸光度。

1.6.7 酶联免疫吸附试验检测胃组织CGRP 表达量严格按照试剂盒说明书步骤检测胃组织中CGRP 的含量。

1.7 统计学方法采用GraphPad Prism 9 软件进行统计学处理和图像分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况和体质量情况比较一般情况比较：空白组大鼠精神良好，反应灵敏，毛发光泽，体质量增长，粪便干燥。造模后，模型大鼠精神萎靡，活动量减少，毛发枯黄，体质量增长缓慢，粪便呈黄绿色稀糊样，有酸腐臭味。干预后，电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠精神好转，活动增加，毛发黄白相间，体质量较前明显增长，粪便呈成形软便。

体质量比较：造模后，造模大鼠体质量显著低于空白组（P＜ 0.05）。干预后，电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠体质量均高于模型组大鼠（P＜ 0.05），低于空白组（P＜ 0.05）。见表1。

表1 各组大鼠体质量比较Tab. 1 Comparison of body mass of rats in each group x±s，g

2.2 胃顺应性和敏感性比较球囊压力20 mmHg时，各组大鼠胃球囊体积/压力和AWR 评分无显著差异（P＞ 0.05）。当压力为40 mmHg 时，与空白组相比，模型组大鼠球囊体积/压力显著降低、AWR评分显著升高（均P＜ 0.05）；与模型组相比，电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组球囊体积/压力明显升高（P＜ 0.05），但AWR 评分无显著改善（P＞ 0.05）。当压力为60、80 mmHg 时，与空白组相比，模型组大鼠球囊体积/压力显著降低（P＜ 0.05）、AWR评分显著升高（P＜ 0.05）；与模型组相比，电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组大鼠球囊体积/压力、AWR 评分均有显著改善（P＜ 0.05）。见表2、3。

表2 不同胃球囊压力下各组大鼠胃球囊体积/压力比值评分比较Tab.2 Comparison of gastric balloon volume/pressure ratio scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，mL/mmHg

表2 不同胃球囊压力下各组大鼠胃球囊体积/压力比值评分比较Tab.2 Comparison of gastric balloon volume/pressure ratio scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，mL/mmHg

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05

组别空白组模型组电针组抑制剂组电针+抑制剂组F值P值80 mmHg 0.27 ± 0.01 0.18 ± 0.01*0.22 ± 0.01#0.21 ± 0.02#0.23 ± 0.01#32.84＜ 0.001例数6 6 6 6 6 20 mmHg 0.16 ± 0.01 0.14 ± 0.02 0.15 ± 0.01 0.15 ± 0.02 0.15 ± 0.01 1.294 0.2993 40 mmHg 0.20 ± 0.02 0.17 ± 0.01*0.19 ± 0.01#0.19 ± 0.01#0.19 ± 0.01#6.209＜ 0.01 60 mmHg 0.25 ± 0.02 0.19 ± 0.01*0.23 ± 0.02#0.22 ± 0.01#0.23 ± 0.01#14.08＜ 0.001

表3 不同胃球囊压力下各组大鼠胃AWR 评分比较Tab.3 Comparison of gastric AWR scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，分

表3 不同胃球囊压力下各组大鼠胃AWR 评分比较Tab.3 Comparison of gastric AWR scores in different groups of rats under different gastric balloon pressures ±s，分

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05

组别空白组模型组电针组抑制剂组电针+抑制剂组F值P值80 mmHg 2.67 ± 0.47 3.83 ± 0.37*3.16 ± 0.37#3.16 ± 0.37#3.00 ± 0.58#4.643＜ 0.01例数6 6 6 6 6 20 mmHg 0.33 ± 0.47 0.67 ± 0.47 0.5 ± 0.5 0.67 ± 0.47 0.83 ± 0.37 0.86 0.50 40 mmHg 1.33 ± 0.47 2.83 ± 0.69*2.33 ± 0.47 2.67 ± 0.75 2.17 ± 0.69 4.383＜ 0.01 60 mmHg 2.00 ± 0.82 3.50 ± 0.50*2.50 ± 0.50#2.67 ± 0.47#2.33 ± 0.47#12.92＜ 0.001

2.3 胃组织HE 染色情况比较肉眼观察各组大鼠胃组织黏膜皱襞清晰，未见出血、溃疡、肿胀等器质性病变。光镜下各组大鼠胃黏膜层、黏膜下层与肌层分界尚清晰，结构完整。见图1。

图1 各组大鼠胃黏膜HE 染色观察Fig.1 HE staining of gastric mucosa of rats in each group

2.4 肥大细胞计数、脱颗粒率与空白组相比，模型组大鼠胃肥大细胞数和脱颗粒率显著增加（P＜ 0.05）；与模型组相比，电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组胃肥大细胞数和脱颗粒率明显减少（P＜ 0.05）。见图2、表4。

图2 各组大鼠胃肥大细胞甲胺蓝染色情况Fig.2 Methylamine blue staining of gastric mast cell of rats in each group

表4 各组大鼠胃肥大细胞计数和脱颗粒率比较Tab.4 Comparison of gastric mast cell count and degranulation of rats in each group ±s

表4 各组大鼠胃肥大细胞计数和脱颗粒率比较Tab.4 Comparison of gastric mast cell count and degranulation of rats in each group ±s

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05

组别空白组模型组电针组抑制剂组电针+抑制剂组F值P值肥大细胞脱颗粒率（%）16.67 ± 13.05 67.64 ± 15.11*31.84 ± 16.21#38.73 ± 11.00#25.97 ± 14.50#9.449＜ 0.001例数6 6 6 6 6肥大细胞记数（个）4.83 ± 2.67 16.50 ± 3.99*9.00 ± 4.00#10.50 ± 4.37#7.83 ± 4.37#6.094＜ 0.01

2.5 胃TRPV1 免疫组化染色情况与空白组比较，模型组胃黏膜层固有层可见TRPV1 强阳性表达，经软件分析平均光密度值，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。与模型组比较，电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组TRPV1 阳性表达程度明显降低（P＜ 0.05）。电针+抑制剂组相比于电针组、抑制剂组阳性表达显著减少（P＜ 0.05）。见图3、表5。

图3 各组大鼠胃黏膜TRPV1 免疫组化染色情况Fig.3 Immunohistochemical staining of TRPV1 in gastric mucosa of rats in each group

表5 各组大鼠TRPV1 免疫组化平均光密度值比较Tab.5 Comparison of average optical density values of TRPV1 immunohistochemistry in each group of rats ±s

表5 各组大鼠TRPV1 免疫组化平均光密度值比较Tab.5 Comparison of average optical density values of TRPV1 immunohistochemistry in each group of rats ±s

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05；与电针+抑制剂组比较，△P ＜ 0.05

TRPV1平均光密度值0.013 ± 0.001 0.063 ± 0.008*0.037 ± 0.005#△0.039 ± 0.005#△0.025 ± 0.004#64.71＜ 0.001组别空白组模型组电针组抑制剂组电针+抑制剂组F值P值例数6 6 6 6 6

2.6 胃NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表达和CGRP含量比较与空白组比较，模型组大鼠胃组织NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表达和CGRP 含量明显上调（P＜ 0.05）；与模型组比较，电针组、抑制剂组、电针+抑制剂组NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表达和CGRP 含量显著下降（P＜ 0.05）；电针+抑制剂组相比于电针组、抑制剂组蛋白表达和CGRP 含量减少（P＜ 0.05）。见图4、表6、7。

图4 各组大鼠胃NGF/TrKA/TRPV1 蛋白印记图Fig.4 Western blot of NGF/TrKA/TRPV1 protein in the stomach of rats in each group

表6 各组大鼠胃NGF、TrKA、TRPV1 相对蛋白表达量比较Tab.6 Comparison of relative protein expression levels of NGF， TrKA， and TRPV1 in the stomach of rats in each group ±s

表6 各组大鼠胃NGF、TrKA、TRPV1 相对蛋白表达量比较Tab.6 Comparison of relative protein expression levels of NGF， TrKA， and TRPV1 in the stomach of rats in each group ±s

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05；与电针+抑制剂组比较，△P ＜ 0.05

TRPV1 0.36 ± 0.03 1.20 ± 0.03*0.57 ± 0.03#△0.59 ± 0.02#△0.49 ± 0.02#826.0＜ 0.001组别空白组模型组电针组抑制剂组电针+抑制剂组F值P值例数6 6 6 6 6 NGF 0.62 ± 0.05 0.91 ± 0.02*0.74 ± 0.05#△0.76 ± 0.04#△0.66 ± 0.04#38.3＜ 0.001 TrKA 0.40 ± 0.03 1.19 ± 0.03*0.57 ± 0.03#△0.60 ± 0.02#△0.49 ± 0.02#742.9＜ 0.001

表7 各组大鼠胃CGRP 含量比较Tab.7 Comparison of CGRP content in the stomach of rats in each group ±s

表7 各组大鼠胃CGRP 含量比较Tab.7 Comparison of CGRP content in the stomach of rats in each group ±s

注：与空白组比较，*P ＜ 0.05；与模型组比较，#P ＜ 0.05；与电针+抑制剂组比较，△P ＜ 0.05

CGRP含量（pg/mg）1.30 ± 0.04 2.04 ± 0.16*1.73 ± 0.09#△1.79 ± 0.10#△1.57 ± 0.08#36.32＜ 0.001组别空白组模型组电针组抑制剂组电针+抑制剂组F值P值例数6 6 6 6 6

3 讨论

胃敏感性增高和胃顺应性降低是FD 的重要病理因素，与上腹痛、餐后饱胀等症状密切相关［16］。本研究结果发现，当胃内球囊压力达40、60、80 mmHg 时，模型大鼠存在显著胃敏感性增高和顺应性降低，表明模型建立成功［12，17］。经电针治疗后，可显著提高40、60、80 mmHg 球囊压力下FD大鼠胃球囊体积/压力比值，改善60、80 mmHg 球囊压力下FD大鼠AWR评分，且疗效与使用NGF抑制剂相当。说明电针很可能通过抑制NGF 表达发挥作用，电针可显著改善FD 大鼠胃内高敏感性。

活化的肥大细胞脱颗粒释放组胺、类胰蛋白酶和NGF 等介质，增加TRPV1 表达，增强疼痛信号的传导，使胃肠敏感性升高［18-19］。WONG 等［11］发现电针可以改善结肠炎模型大鼠直肠肥大细胞活化率。本研究证实了电针对FD 大鼠中胃黏膜肥大细胞的抑制作用。此外，本研究率先观察到电针组、抑制剂组、抑制剂+电针对肥大细胞活化程度具有相同的下调效果，笔者猜测这可能与NGF同时是一种肥大细胞触发剂有关［19］。

NGF 当与高亲和力受体TrKA 结合后，可激活下游信号通路，引起TRPV1 敏化［22］。TRPV1 作为一种非选择性阳离子通道，广泛分布于伤害性感觉神经纤维中［23］。TRPV1 被激活后，细胞外Ca2+内流增加，进而产生动作电位，诱导神经肽释放如CGRP，从而引起内脏高敏感性。前期有研究发现电针对FD 大鼠胃TRPV1 具有下调作用，但电针是否通过TRPV1 上游关键通路NGF/TrKA 对其产生调控，尚无研究证实。为此，本研究设计了NGF 抑制剂组和电针+NGF 抑制剂组。本研究发现FD 大鼠胃NGF、TrKA、TRPV1 蛋白表达显著上升，下游分子CGRP 含量明显升高，电针治疗具有显著下调作用，且效果与使用NGF 抑制剂一致，但不及电针+抑制剂组。免疫组化呈现了相同趋势的结果，进一步提示了电针对主要表达于胃黏膜固有层TRPV1 具有下调作用。推测电针通过抑制NGF/TrKA/TRPV1 通路的表达，降低下游CGRP 的释放，且电针与NGF 抑制剂对该抑制该通路存在协同作用。基于NGF/TrKA/TRPV1 在胃肠高敏感性性中的重要作用，本研究首次发现了电针对该通路在FD 大鼠胃组织中的下调效应。

综上所述，本研究发现电针可以改善FD 大鼠胃高敏感性，其机制可能与减少胃肥大细胞数量和脱颗粒率，减少NGF/TrKA/TRPV1 通路效应分子表达，抑制CGRP 释放有关。

【Author contributions】JIN Shuwen performed the experiments and wrote the article. LIU Jiabao， FAN Jianchao and HAN Yongli performed the experiments. LIU Wei and ZHOU Li revised the article. ZHANG Hongxing and XU Paidi designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.