敲除成纤维细胞生长因子2基因抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移侵袭并促进细胞凋亡

2023-12-12 10:41张正花龚荣府方文
实用医学杂志 2023年22期
关键词:细胞周期质粒测序

张正花 龚荣府 方文

1贵州医科大学附属医院临床检验中心(贵阳 550004);2贵州医科大学医学检验学院(贵阳 550004)

乳腺癌是威胁全球女性健康及生存最常见的恶性肿瘤[1],发病率和病死率呈逐步上升的趋势[2-3]。尽管在乳腺癌上使用免疫治疗和化疗治疗等治疗策略取得了很大进展,但许多乳腺癌患者的生存结局仍然很差[4-5]。因此,探索更多新的分子标志物来帮助设计更好的临床治疗方法至关重要。成纤维细胞生长因子2(FGF2)是一种促血管生成因子[6],与多种恶性肿瘤的增殖,迁移侵袭及炎症反应等密切相关[7-9]。但目前FGF2 调控乳腺癌细胞的生物学行为的机制还尚未明确。为此,本研究将通过CRISPR/cas9 技术敲除FGF2 基因在MCF-7细胞中的表达,观察其对MCF-7 细胞的增殖、迁移侵袭及凋亡的影响,为寻找乳腺癌新的有效治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料人乳腺癌细胞MCF-7 购自赛柏康(上海)生物技术股份有限公司;FGF2 重组抗体购自abcam 公司;GAPDH、CDK2、cyclinA、Bax 及Bcl-2单克隆抗体购自Proteintech 公司;DH-5α 大肠杆菌感受态、胶回收试剂盒购自vazyme 公司;T4 DNA连接酶、嘌呤霉素(puromycin dihydrochloride)、Lipo8000™转染试剂购自碧云天公司;病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2、lenticrispv2 载体购自广州艾基生物技术有限公司;质粒提取试剂盒购自中国天根公司;细胞周期检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司;CCK-8 试剂购自大连美仑生物公司;sgRNA 引物合成及质粒测序由北京擎科生物科技股份有限公司完成;细胞培养耗材购自NEST 公司、Gibco 公司和北京索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 FGF2 基因敲除载体及稳转细胞系的构建FGF2-sgRNA 的设计:CRISPR 的引物通过http:// chopchop.cbu.uib.no/平台设计。引物设计序列见表1。合成的sgRNA-Oligo 引物经退火后与酶切质粒载体lenticrispv2 连接。将构建的质粒转化到感受态细胞DH-5α 中,送菌液至擎科测序公司进行测序验证,将测序结果进行比对成功的质粒菌液进行扩增,按照无内毒素试剂提取试剂盒进行提取质粒。将提取的质粒CRISPR-cas9-NC 和CRISPR-cas9-FGF2 与包装质粒pMD2.G、psPAX2,在Lipo8000TM转染试剂的作用下将质粒转染进293T细胞中收集病毒液进行浓缩,并用病毒液感染MCF-7 细胞,72 h 后加入嘌呤霉素(2 μg/mL)进行细胞筛选,利用Western blot 检测筛选细胞蛋白验证FGF2 基因敲除情况,将FGF2基因敲除组MCF-7细胞命名为FGF2-sgRNA1、FGF2-sgRNA2、FGF2-sgRNA3,对照组命名为CRISPR-cas9-NC。

表1 针对FGF2 基因设计的3 个sgRNA 靶序列Tab.1 Three sgRNA target sequences designed for FGF2 gene

1.2.2 Western blot 检测FGF2 蛋白敲除效率水平及周期、凋亡相关蛋白取不同处理的细胞,用预冷的PBS 洗2 遍,根据RIPA 蛋白裂解液提取蛋白,将蛋白上样电泳。待蛋白分开后,转膜、封闭、敷一抗FGF2、CDK2、cyclinA、Bax、Bcl-2 抗体和GAPDH 抗体,4 ℃冷库过夜,次日洗膜3 次,敷对应二抗,室温1 h,洗膜3 次,随后曝光显影。

1.2.3 CCK-8 实验将两组细胞接种于96 孔板中,每孔100 μL/2 000 个细胞,每一组铺3 个复孔,同时铺板5 个时间段,分别在0、24、48、72、96 h 加入CCK-8 试剂反应3 h 测定OD值。

1.2.4 细胞划痕实验将不同处理的细胞铺于六孔板,待细胞长满后用直尺和无菌枪头画十字架,分别在0、24、48、72 h 定位拍照记录细胞迁移愈合情况。

1.2.5 Transwell 实验将细胞用无血清DMEM培养基饥饿培养1 d,以每孔3 × 105个细胞、铺三个复孔计算,放37 ℃ 5%CO2培养箱中孵育48 h,用4%多聚甲醛固定20 min,用0.5%结晶紫染色20 min,拍照计数。检测细胞侵袭能力需要先将基质胶以1∶15 稀释后吸100 μL 铺于小室上室过夜凝固,细胞以每孔6 × 105铺于小室内,其他条件与上述条件一致。

1.2.6 细胞集落形成实验将两组细胞铺于六孔板,以每组每孔5 × 102个细胞为宜,培养到15 d(中途每隔3天换一次液),用4%多聚甲醛固定20 min,用0.5%结晶紫染色20 min,洗掉待干燥后拍照留存,以每个集落> 50个细胞计数集落统计成图。

1.2.7 MCF-7 细胞周期检测按照试剂盒说明书收集细胞后固定染色,应用流式细胞仪检测对照组与FGF2 基因敲除组细胞 G0/G1 期、S 期和G2/M期比例。

1.2.8 数据处理与统计分析应用SPSS 26.0 软件和GraphPad prism 9.0.0 软件进行统计分析,实验数据两组间统计学差异比较采用t检验,P< 0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FGF2 基因敲除稳转质粒的构建质粒载体lenticrispv2 酶切成功,见图1A。sgRNA-Oligo 退火序列与质粒载体酶切产物连接、转化后,送菌液至擎科测序公司进行测序,比对测序数据,均显示能与sgRNA引物匹配,见图1B,表明sgRNA-1、sgRNA-2、sgRNA-3 引物均成功与质粒载体连接。

图1 FGF2 基因敲除的稳转质粒Fig.1 FGF2 gene knockout plasmid

2.2 敲除FGF2 基因稳转细胞株的构建通过Western blot检测结果显示,与对照组(0.910 ± 0.076)相比,FGF2-sgRNA1 组(0.027 ± 0.008)的FGF2 敲除效果最明显,差异有统计学意义(P< 0.000 1,图2),故选择FGF2-sgRNA1 序列进行后续实验,用CRISPR-cas9-FGF2 命名。

图2 不同FGF2-sgRNA 质粒敲除FGF2 基因的蛋白表达水平Fig.2 Protein expression levels of FGF2 gene knocked out bydifferent FGF2-SgrNA plasmids

2.3 FGF2基因敲除后抑制MCF-7细胞的增殖细胞集落形成实验和CCK-8 实验表明,与对照组相比,FGF2 基因敲除组的MCF-7 细胞增殖克隆数[(55.670 ± 5.130)vs. (26.000 ± 3.000)]及增值数量[(2.735 ± 0.376)vs. (2.218 ± 0.089)]显著下降,差异有统计学意义(P< 0.001,图3A、3B)。结果说明,敲除FGF2基因显著抑制了MCF-7 细胞的增殖。

图3 敲除FGF2 基因显著抑制MCF-7 细胞的增殖Fig.3 The proliferation of MCF-7 cells was significantly inhibited after FGF2 gene was knocked out

2.4 FGF2 基因敲除后抑制MCF-7 细胞的迁移和侵袭通过细胞划痕实验和Transwell 实验结果显示,与对照组相比,FGF2 基因敲除组细胞的迁移愈合[(53.017 ± 2.996)vs. (39.757 ± 2.898)]和迁移[(109.667 ± 11.240)vs. (46.667 ± 3.512)]、侵袭[(103.330 ± 7.571)vs. (25.000 ± 5.000)]能力明显减弱,差异有统计学意义(P< 0.01),见图4A、4B。

图4 敲除FGF2 基因后MCF-7 细胞的迁移和侵袭能力明显降低Fig.4 The migration and invasion ability of MCF-7 cells were significantly reduced after FGF2 gene was knocked out

2.5 FGF2 基因敲除后可阻滞细胞周期根据细胞周期检测结果显示,与对照组(32.453 ± 1.137)相比,FGF2基因敲除组(40.613 ± 2.621)的S期细胞比例明显升高,差异有统计学意义(P< 0.01,图5A)。通过Western blot 检测细胞S期相关周期蛋白显示,CDK2 蛋白(0.719 ± 0.031)和cyclinA 蛋白(0.591 ±0.054)表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.001,图5B)。结果说明敲除FGF2 基因后可将MCF-7 细胞阻滞在S 期。

图5 敲除FGF2 基因后对MCF-7 细胞周期的影响Fig.5 Effect of FGF2 gene knockout on MCF-7 cell cycle

2.6 FGF2基因敲除后可促进MCF-7细胞的凋亡通过Western blot 检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2 显示,FGF2 基因敲除组中Bax 表达(1.210 ± 0.068)高于对照组(0.591 ± 0.051),Bcl-2表达(0.479 ± 0.055)低于对照组(1.112 ± 0.116),差异有统计学意义(P<0.001),Bcl-2/Bax的比值[(1.775 ± 0.141)vs. (0.417 ±0.023),P< 0.001]减低(P< 0.000 1),见图6。结果提示敲除FGF2 基因促进了MCF-7 细胞的凋亡。

图6 敲除FGF2 基因后对MCF-7 细胞凋亡的影响Fig.6 Effect of FGF2 gene knockout on apoptosis of MCF-7 cells

3 讨论

乳腺癌的恶性发展涉及了复杂过程,主要包括表观遗传学变化、基因表达和信号通路[10-11]。寻找乳腺癌中异常表达的重要功能基因是研究癌症发展机制的重要途径。乳腺癌是一种血管依赖性肿瘤,血管生成是乳腺癌转移的关键,并预测预后不良[12]。FGF2 是一种血管生成因子,与强血管化和高特异性相关,在乳腺癌癌前阶段表达上调[13]。研究显示,FGF2 受多种基因调控激活多条信号通路来影响实体肿瘤的增殖,迁移侵袭和转移[14-16]。已有研究[17]表明FGF2 是癌症对抗化疗的潜在靶点。然而,FGF2 基因在乳腺癌细胞中的作用尚不清楚。

CRISPR/Cas9 技术可高效稳定的敲除基因,被广泛用于癌症的研究[18]。本研究采用CRISPR-cas9技术成功敲除了MCF-7 细胞中的FGF2 基因,发现MCF-7 细胞的迁移、侵袭和增殖生长明显减弱。细胞周期停滞是细胞生长抑制的重要原因,本研究也发现敲除FGF2 基因诱导MCF-7 细胞阻滞在S期。细胞周期主要是由cyclin 和CDK 协同调控,其中,cyclinA 能与CDK2 形成活性激酶复合物,促使细胞从S 期进入G2 期,使细胞增殖过度,最终引起癌变[19]。当细胞内CDK2 和cyclinA 表达下调时,细胞S 期将受到阻滞,细胞增殖将被抑制[20]。在本研究中敲除FGF2 基因后观察到CDK2 和cyclinA 的蛋白表达水平显著下调,这与细胞周期中检测到的阻滞在S 期结果相吻合。

有研究表明[21],上调FGF2 可促进Bcl-2 的表达而抑制Bax 的表达来减轻人瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡。细胞凋亡由Bcl-2 家族和半胱天冬酶家族调节[22]。Bcl-2 能阻止肿瘤细胞凋亡,与Bax有负调控关系[23]。Bax 和Bcl-2 是引起细胞凋亡的必需因子,可作为判断细胞凋亡的重要依据[24-25]。本研究发现,敲除FGF2 基因后,与对照组相比,敲除组细胞中的Bcl-2 降低,Bax 升高。结果表明,敲除FGF2 基因后影响了Bcl-2 和Bax 的表达来促进乳腺癌细胞的凋亡。

综上所述,本研究通过CRISPR/cas9 技术成功在MCF-7 细胞中敲除FGF2 基因。敲除FGF2 基因对MCF-7 细胞的增殖、迁移和侵袭均有显著的抑制作用,并促进细胞凋亡,与乳腺癌的恶性进程密切相关。因此,FGF2 基因具有成为治疗乳腺癌的重要生物标志物及治疗靶标的潜力。但目前本研究只注重了体外实验,还未进行体内验证及具体调控的分子机制,这些都是我们后续研究的重点。

【Author contributions】ZHANG Zhenghua performed the experiments and wrote the article. FANG Wen and GONG Rongfu designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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