美国多花黑麦草种子中致死粒线虫的检疫鉴定

俞禄珍，宋绍祎，李 帅

（上海海关, 上海 200135）

致死粒线虫(Anguina funesta)隶属于粒线虫属，主要为害一年生硬直黑麦草(Lolium rigidum)和多花黑麦草(L.multiflorum)[1]。两种黑麦草均可作为优质饲草，特别是多花黑麦草在我国被广泛栽培[2]。致死粒线虫可造成寄主饲草的产量下降，而且还是产毒拉塞氏杆菌(Rathayibacter toxicus)的传播介体，被国内外广泛关注[3-5]。产毒拉塞氏杆菌可侵染植物产生棒状毒素，棒状毒素是自然界产生的致命的毒素之一，该毒素热稳定性强、可不断富集，可引致牛、马、羊、猪、鸡等多种动物中毒致死[6-7]。1978年，澳大利亚报道昆士兰州5 591 头羊、232 头牛因取食了感染该细菌的黑麦草而中毒死亡[1,6]。该细菌侵染寄主植物时，需要传播媒介线虫在寄主上先产生伤口，才能从伤口侵染植物，而致死粒线虫则是该细菌的重要媒介线虫[1]。

鉴于致死粒线虫对草业、畜牧业危害极大，美国、智利、阿根廷、澳大利亚、纳米比亚、瑙鲁、南非已将其列入检疫性有害生物名录，严防该线虫扩散传播[1]。致死粒线虫可侵染寄主花序形成虫瘿，受侵染的植物不能正常结籽，其籽粒变为虫瘿；收获植物种子时，虫瘿混入健康植物种子，随健康种子的调运而远距离传播扩散[6-8]。目前，该线虫在美国(俄勒冈州)、澳大利亚均有分布，在我国尚未见分布[7]。

我国是草原大国但却是草坪业弱国。2020年，我国草坪草种年需求量约15 万t，国产草坪草种生产能力不足，故羊茅属(Festuca)、草地早熟禾(Poa pratensis)和黑麦草属(Lolium)等生态草种、草坪草种90%以上依赖进口[9]。致死粒线虫的寄主是黑麦草属草种，故其随进口草种传入我国的风险很高。同时，种子入境后直接播种用于绿化或生产青饲料，很少进行去除虫瘿的操作。加强来自疫区的进境草种的检疫工作，严防该线虫传入我国刻不容缓。

2021 年，上海口岸于全国首次在进境多花黑麦草种子中截获致死粒线虫。由于在进境多花黑麦草种子中仅截获幼虫，而仅根据幼虫形态很难准确鉴定。本研究采用形态学与分子生物学相结合的方法对所截获的粒线虫属幼虫进行鉴定，以期为口岸检疫部门准确鉴定该线虫提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 线虫分离

进境草种子样品中粒线虫属线虫活动性不强，采用传统的浅盘法分离得到线虫较少。上海海关动植物与食品检验检疫技术中心植物检疫实验室参考Meng 等[4]的方法并进行了改良，具体如下：1)称取黑麦草种子约100 g 倒入1 L 烧杯中(约至300 mL刻度线)，加水至约800 mL，用玻璃棒搅拌至草种子完全湿润，室温静置1～2 d；2)用玻璃棒快速搅拌30 s 使烧杯底部的草种子悬浮起来，静置片刻(等待大部分草种子沉底)，将上悬液(水及浮于水中未沉底的草种子)一起倒入套筛(上筛孔径为0.85 mm，下筛孔径为0.038 5 mm)中，并用水连续冲洗套筛后，将下筛网筛中的筛上物冲洗至培养皿中，待镜检；3)向烧杯中重新加水至约800 mL 之后重复第2 步骤，重复1～3 次。将获得的所有分离液镜检。

1.2 形态学鉴定

将分离得到的2 龄幼虫制片，在光学显微镜(ZEISS Imager.Z1)下进行形态观察、拍照测量(AxioVision Rel.4.8)，并采用De Man 公式对线虫进行测计。

1.3 分子生物学鉴定

1.3.1 线虫DNA 提取

用挑针挑取幼虫若干条, 放入去离子水中洗涤3 次，备用。挑取单条经过洗涤的线虫，用挑针捅破或割成多段，采用DNeasy Blood&Tissue Kits (Qiagen)试剂盒提取线虫DNA。

1.3.2 通用引物PCR 扩增

采用28S 通用引物对线虫DNA 进行PCR 扩增：引物为D2A (5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAA GTTG-3′)，D3B (5′-TCGGAAGGAACCAGCTAC TA-3′)[10]。采用线虫ITS 通用引物对线虫DNA 进行PCR 扩增：引物为F194 (5′- CGTAACAAGGTA GCTGTAG-3′)，5368r (5′-TTTCACTCGCCGTTAC TAAGG-3′)[11-12]。

PCR 反应体系包括：10 × PCR Buffer (Mg2+free)(TIANGEN) 2.5 μL，Mg2+(25 mmol·L-1) (TIANGEN) 2 μL，dNTP Mix (2.5 mmol·L-1) (TIANGEN) 2 μL，引物(5 μmol·L-1) (上海生物工程有公司合成)各0.5 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1) (TIANGEN)0.4 μL，ddH2O 15.1 μL，总体积25 μL。扩增程序为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，40 个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1 ×TAE 缓冲液中电泳，EB 染色后用凝胶成像系统分析。

将所得PCR 产物送上海华大基因生物公司测序，测得的序列用Seqman 软件比对后进行校对和拼接，并在GenBank 中BLAST，进行序列分析，进一步利用MEGA 6.0 软件以最大似然法构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 形态描述与测计值

2.1.1 形态描述

幼虫：线虫热杀死后呈蠕虫形；唇区平，略缢缩，口针弱，口针基部球小；食道垫刃型，食道前体部圆柱体状，中食道球较小，纺锤形；后食道腺梨形，不覆盖或略覆盖肠。尾部尖削，肛门不明显(图1)。

2.1.2 测计值

本研究致死粒线虫种群幼虫的形态测计值和美国种群比较显示：与Meng 等[4]描述的种群相比，a、b、c、口针长、尾长、中食道球长及宽、体宽等值基本吻合；体长、食道较长一些，但其数值范围部分重叠(表1)。

表1 截获的致死粒线虫幼虫与其他致死粒线虫种群的测计值比较Table 1 Comparison of measured values between different populations of juvenile Anguina funesta

2.2 28S 及ITS 序列系统发育分析

2.2.1 28S 序列分析

多花黑麦草种子中截获的粒线虫幼虫，测序获得742 bp 的DNA 序列(系统登录号MH OM403184)，与GenBank 中登录的A.funesta的序列相似性达100.00% (登陆号MG321209) (图2)。基于28S 区序列构建的系统进化树显示，截获的粒线虫与GenBank中登录的致死粒粒线虫A.funesta位于同一进化枝上(图2)。

图2 基于粒线虫属线虫28S 区序列构建的系统进化树Figure 2 Phylogenetic tree of Anguina sp.based on 28S sequences (maximum likelihood, ML)

2.2.2 ITS 序列分析

多花黑麦草种子中截获的粒线虫属幼虫，经ITS 测序获得长度为778 bp 的序列(系统登录号OM403183)，与GenBank 中登录的A.funesta的相似性达99.86% (登陆号KM114435)～100.00% (登陆号KM114438、KM114439、AF396347) (图3)。基于rDNA-ITS 区序列构建的系统进化树可见，测序获得序列与A.funesta位于同一进化枝上(图3)。

图3 基于粒线虫属线虫ITS 区序列构建的系统进化树Figure 3 Phylogenetic tree of Anguina sp.based on ITS sequences (maximum likelihood, ML)

3 讨论与结论

由于国产草种供给不足，我国长期进口大量草种，特别是禾本科草种子[1]。粒线虫属线虫是禾本科草种的重要寄生线虫，我国口岸多次在进境草种中截获粒属线虫，如剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)、维氏粒线虫(Anguina wevelli)[13-14]，传入我国将对草产业、畜牧业产生重大威胁，我国口岸部门应加强对进境草种的检疫力度，防止该类线虫传入为害。

粒线虫属是一类最早被描述的植物寄生线虫，历史悠久，但该属的分类鉴定却较复杂。至今，该属的有效种个数仍存在较大争议：Siddiqi 认为该属有11 个有效种，Andrassy 认为有13 个，而Subbotin和Riley 认为该属的有效种将近21 个[15]。由于粒线虫属的雌虫和雄虫形态特征较相似，且部分形态测计值范围跨度较大，因此经典的形态分类鉴定较困难[15]。历史上存在多个同物异名现象，如剪股颖粒线虫和维氏粒线虫(Anguina wevelli)、致死粒线虫曾为同物异名，这些线虫是否为独立有效种曾引发广泛讨论[16]。本研究截获的致死粒线虫与近似种剪股颖粒线虫的主要形态区别为致死粒线虫的雌虫后阴子宫囊与肛阴距比(64%～72%)大于剪股颖粒线虫(常小于50%，偶有达60%)；致死粒线虫雄虫交合刺(长16～28 μm)短于剪股颖粒线虫(长25～40 μm)[16]。由于上述两种线虫形态测计值存在部分重叠，准确的形态鉴定非常困难。

一段时期内，粒线虫属线虫在寄主植物地上部分产生的症状、寄主范围、寄主专化性也曾作为该属线虫鉴定的依据之一[15]。进入新世纪以来，分子生物学的兴起与应用，为线虫的分类鉴定提供了新的手段。关于粒线虫属线虫的分子鉴定，Powers 等[16]于2001 年最早开展研究，其基于ITS1 的PCR-RFLP图谱显示，曾经同物异名的剪股颖粒线虫、维氏粒线虫(Anguina wevelli)和致死粒线虫酶切图谱均不同，系统进化树也显示上述3 种线虫聚于不同进化枝，故认为分子特征支持上述3 种线虫为独立有效种，并认为ITS1 区可用于粒线虫属线虫鉴定。近年来，多位学者基于该属线虫的ITS 区序列开发了分子检测方法[15,17]，特异引物PCR 法[18]、实时荧光PCR法[19]。由于在检测种子或植物组织样品时，分离得到的粒线虫属线虫常为幼虫[20]，难以进行鉴定，采用分子生物学手段进行辅助鉴定可一定程度上弥补形态学鉴定方法的不足。2012 年，Meng 等[4]首次报道美国发生致死粒线虫，但在田间调查样本中未发现成虫，其针对分离得到的幼虫采用了形态学与分子生物学(PCR-RFLP)相结合的方法进行鉴定。

本研究综合形态学和分子生物学特征，确认从美国多花黑麦草种子中截获的粒线虫属线虫为致死粒线虫，这是我国口岸首次报道截获鉴定该线虫，为口岸检疫部门准确鉴定提供技术支持和决策参考。