外源CO2 诱导土沉香树体结香效应及生理响应*

刘高峰 周再知 赵威威 张青青 黄桂华

（1.中国林业科学研究院热带林业研究所 广州 510520；2.菏泽学院 菏泽 274015）

土沉香（Aquilaria sinensis），原名牙香树，又名白木香，为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）常绿乔木，是我国特有珍贵药源植物（中国科学院中国植物志编辑委员会，1999）。沉香为土沉香树体受刺激或损伤后产生的分泌物与木质结合形成的沉香木，是传统名贵药材和珍贵香料（梅文莉等，2013；Chenet al.，2018），可用于消化、呼吸、心脑血管等疾病的治疗（Espinozaet al.，2014），也可用于香水、化妆品的制作（Naef，2011）。近年来，由于沉香价格不断上升以及人为过度采伐，沉香野生资源趋于枯竭。为满足市场对沉香的需求并保护野生沉香资源，沉香原产国加强了对沉香栽培和结香技术的研究（Donovanet al.，2004；van Thanhet al.，2015；Mohamedet al.，2010）。

通常认为，生物或非生物因素胁迫可诱导沉香形成，该过程受寄主树、微生物和环境的影响（Tanet al.，2019；Espinozaet al.，2014），各种伤害（物理、化学）或真菌侵染均可作为激发子诱导土沉香结香（张争等，2010）。目前，人工诱导土沉香结香主要有物理造伤法、化学法和生物法，其中物理造伤和化学、真菌输液方式被普遍应用（Blanchetteet al.，2009），但这些方法存在结香质量不理想、产量不确定等问题，且易引发树体腐烂（梅文莉等，2014）。早期研究表明，木材内部高浓度CO2有利于黑荆树（Acacia mearnsii）心材中类黄酮化合物的形成（Carrodus，1971）。Nilsson 等（2002）发现树干填充CO2可诱导欧洲赤松（Pinus sylvestris）形成不同于边材的变色木材，且诱导的变色木材与天然心材成分相近。刘小金（2012）在研究檀香（Santalumalbum）心材发育时发现，树干填充CO2可诱导心材的形成，促进α-檀香醇和β-檀香醇合成，提高精油产率。这些研究均表明，树体内高浓度CO2能够促进树木次生代谢物质的合成，诱导木材变色；但树干填充CO2是否能够诱导土沉香结香、结香效果及生理响应机制如何未见报道。

鉴于此，本研究以土沉香树为试验材料，采用外源CO2填充树干的方式诱导结香，检测木芯抗氧化酶系活性和结香范围，评价结香质量，探明CO2诱导土沉香的结香过程与抗逆防御反应，以期为阐明CO2诱导土沉香结香机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在广东省惠州市惠阳区永湖镇11 年生土沉香人工林中，选取长势均匀、健康、平均胸径13.42±0.63 cm和平均树高5.18±0.79 m 的土沉香树开展树干充气试验。高压CO2气体纯度为99.9%。沉香四醇标准品购自Glpbio 公司，纯度大于99.5%。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 采用随机区组设计，设置4 个处理，即每隔7 天（T1）和15 天（T2）充气1 次、树干打孔（CK1）和不作任何处理（CK2）。每小区处理5 株，重复4 次，共计140 株。

1.2.2 充气方法 选择晴天，在树干50 cm 高度处沿水平方向钻直径1 cm、长9 cm 的小孔，保留一定厚度不钻透树干。钢管缠绕防水薄膜后插入树孔一定深度，与树干接口处涂胶密封，钢管外接橡胶管。将高压瓶中的CO2气体通过减压器减至0.1 MPa 后，经橡胶管充入树孔内，充气量为树孔和树体外胶管的体积之和，采用流量计计量填充气体量。按试验设计持续处理3 个月。

1.3 测定方法

1.3.1 木质部组织结构内含物观察 分别在处理前以及处理后7 和10 个月时，用生长锥取充气孔上方3 cm处木芯，置于FAA 固定液中备用。实验室内，将固定液中的木芯制成2 mm 薄片，扫描电镜（JSM-6510LV，Japan）下观察木质部组织结构变化并拍照。

1.3.2 木芯变色范围测定 处理后10 个月时，沿树干纵向方向，分别在充气孔上、下方1 cm 处每隔2 cm钻取木芯，待木芯没有黑色结香区后，依次间隔3 cm钻取木芯，直到木芯全为白木。在树干横截面方向上，分别在充气孔左、右1 cm 处每隔2 cm 钻取木芯，直到木芯全为白木。将木芯黑色区域称作沉香区，将含有部分黑色油线的浅褐色区域称作过渡区，分别测其木芯径向变色深度。每个处理取5 株树，根据纵向变色长度和径向变色深度，利用Image J1.8.0 软件计算纵切面变色面积。

1.3.3 醇溶性提取物含量测定 处理后7 和10 个月时，在充气孔上方3 cm 处取5 cm 厚半圆片，将结香区（黑色）和过渡区（浅褐色）剥离开，分别置于40 ℃干燥箱内烘干至恒重，样品粉碎，过40 目筛网。称取2.00 g 木粉置于具塞离心管中，加入95%乙醇20 mL，在水浴中超声处理 30 min 后取上清液，重复操作1 次。合并2 次上清液，过0.45 μm 滤膜，定容至50 mL，待测。将1.5 mL 滤液装入称量好的2 mL 离心管中，置于旋转浓缩仪40 ℃下浓缩。待液体挥发完至恒重，称量并计算醇溶性提取物含量，每个处理每次随机取5 株树，每份提取液重复测定10 次。

1.3.4 沉香四醇含量测定 采用液相色谱质谱联用仪（Sciex 4000，SCIEX，USA；Sciex 4000 QTRAP®）测定沉香四醇含量。测定条件：色谱柱Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流动相水为0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脱为0～1 min10%B；1～3.5 min10%～70%B；3.5～4 min70%～95%B；4～5.9 min95%B；5.9～6 min10%B，6～8 min10%B。柱温40 ℃，流速0.3 mL·min-1，进样量1 μL。配制不同质量浓度沉香四醇标准溶液，绘制标准曲线，然后从1.3.3 中取样品提取液，测定并计算样品中沉香四醇含量。

1.3.5 抗氧化酶活性测定 充气开始后第30、60、90、120、150 天，用内径 1 cm 的生长锥在充气孔上方2 cm处钻取木芯，锡箔纸包好置于液氮中备用。每小区、每个处理选取1 株，当天将样品带回实验室，用液氮磨成粉，超低温冰箱-80 ℃保存。POD、SOD、CAT活性和MDA 含量采用酶联免疫分析试剂盒测定，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。

1.3.6 数据统计与分析 采用Excel 软件进行数据处理，利用ImageJ 1.8.0、 SPSS19.0 和Origin2021 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 CO2 处理前后木质部组织结构内含物变化

树干填充CO2处理前，木质部导管纹孔、管壁清晰可见，无任何内含物（图1A）；射线薄壁细胞内含有许多淀粉粒（图1B）。处理后7 个月时（以T1 为例），导管已部分堵塞（图1C），射线薄壁细胞内淀粉粒消失，并出现絮状侵填物富集，但未填满细胞腔（图1D）；处理后10 个月时，T1 处理下导管、射线薄壁细胞内油脂类物质或侵填物大量富集，堵塞面积变大甚至完全堵塞（图1E、F）。CK1 处理后7 个月时，部分射线薄壁细胞内仍可观察到淀粉粒，仅有少量侵填体（图1G）；处理后10 个月时，导管内可观察到明显的内含物（图1H），射线薄壁细胞内侵填体数量增多，出现部分堵塞（图1I）。由此可见，与CK1 相比，树干填充CO2可明显加快射线薄壁细胞内淀粉的分解，促进导管和射线薄壁细胞内侵填体形成。

图1 组织结构内含物变化Fig.1 The inclusion changes of tissue structure

2.2 变色范围

2.2.1 纵向变色长度和横向变色宽度 树干填充CO2加速土沉香木质部纵向、横向变色。从图2A 可看出，处理后10 个月时，T1 和T2 处理下沉香区、过渡区纵向变色长度差异不显著，但均显著高于CK1 处理。T1 处理下沉香区、过渡区和纵向变色总长度分别达8.12 cm、18.33 cm 和26.45 cm，是CK1 处理的3.36、3.05 和3.14 倍。不同处理的纵向变色长度均大于横向变色宽度。横向变色上（图2B），T1 处理下充气孔左、右1 cm 处检测到黑色结香区产生，而T2 和CK1 处理均未发现。T1 处理下横向变色总宽度达4.17 cm，分别比T2 和CK1 处理提高32.38%和69.51%。纵向变色总长度和横向变色总宽度不同处理的高低顺序均为T1＞T2＞CK1＞ CK2（不变色）。较高频次（7天1 次）的树干填充CO2比低频次（15 天1 次）处理诱导变色效果更好。

图2 不同处理木质部纵向变色长度与横向变色宽度Fig.2 Longitudinal discoloration length and horizontal discoloration width in different treatments

2.2.2 径向变色长度与纵切面变色面积 充气处理后10 个月时，离充气孔越近，沉香区和过渡区木质部径向变色越深（图3）。T1 处理下，充气孔上方1 cm 处，黑色沉香区径向变色深度为2.88 cm，分别是T2 和CK1 处理的1.47 和6.95 倍；径向总变色深度达9.87 cm，分别比T2 和CK1 处理提高25.73%和61.27%。可见，较高的充气频率有助于诱导土沉香木质部径向变色。

图3 不同处理纵向、横向木芯的径向变色深度Fig.3 Radial discoloration depth of longitudinal and horizontal wood cores in different treatments

树干填充CO2可增加土沉香变色面积，尤其是纵切面变色面积（表1）。处理后10 个月时T1 和T2 处理纵切面沉香区、过渡区和总变色区面积均显著高于CK1 处理，其中T1 处理下3 个区面积均最大，分别是CK1 处理的18.79、2.96 和3.38 倍。T2 处理下3 个区面积也显著高于CK1 处理，分别是CK1 处理的11.9、2.15 和2.41 倍。

表1 不同处理10 个月时纵切面变色面积①Tab.1 The discoloration areas in different treatments

2.3 醇溶性提取物含量

填充CO2可提高树干木质部沉香区和过渡区醇溶性提取物含量，且沉香区高于过渡区。处理后7 个月时，T1 处理下沉香区醇溶性提取物含量达19.87%（表2），分别是T2、CK1、CK2 处理的1.26、1.43 和5.24 倍；T2 处理下醇溶性提取物含量也明显高于CK1 和CK2 处理。随诱导时间增长，沉香区中醇溶性提取物含量逐渐增加，T1 处理后10 个月时，醇溶性提取物含量达21.27%，比T2、CK1 处理分别提高25.41%和42.08%，与处理后7 个月时相比提高7.05%。过渡区中，T1 处理下醇溶性提取物含量仍显著高于其他3 个处理，但与处理后7 个月时相比显著下降4.28%。

表2 不同处理土沉香醇溶性提取物含量①Tab.2 The content of alcohol soluble extraction in different treatments

2.4 沉香区沉香四醇含量

处理后7 个月时，T1 处理下结香区中沉香四醇含量达0.12%，分别是T2、CK1 处理的1.24 和2.14 倍；T2 处理下结香区中沉香四醇含量比CK1 处理高72.30%。随诱导时间增长，各处理沉香四醇含量显著上升（图4）。处理后10 个月时，T1 处理下沉香四醇含量达0.29%，分别是T2、CK1 处理的1.26 和2.11 倍，是处理后7 个月时沉香四醇含量的2.50 倍。T2 处理下沉香四醇含量也比CK1 处理高67.96%，而CK2 处理均未检测到沉香四醇。总之，树干填充CO2可诱导土沉香产生沉香四醇，其结香区含量远高于《中国药典》规定的0.1%含量标准（中华人民共和国药典委员会，2015）。

图4 不同处理下沉香四醇含量Fig.4 The content of agarotetrol in different treatments

2.5 抗氧化酶POD、SOD、CAT 活性及MDA 含量变化

树干填充CO2后，不同诱导时间下土沉香木芯中抗氧化酶POD、SOD、CAT 活性不同。以T1 处理为例，T1 处理土沉香木芯中POD 活性随诱导时间增长先升高后下降，第60 天时达到最大值，分别比CK1、CK2 处理高6.87%和11.07%，随后活性逐渐下降，到第150 天时降至最低值，但仍比CK2 处理高8.92%。CK1 处理后POD 活性整体呈下降趋势，但波动性较大；第30 天时POD 活性达最大值，比CK2 处理高15.90%，第150 天时活性最低，与CK2 处理无明显差异。T1 处理后SOD 活性先下降后升高，第90 天时SOD 活性最低，比CK2 处理低9.98%，随后活性逐渐升高，第120 天时SOD 活性略高于CK2 处理。CK1处理第30 天SOD 活性明显低于CK2 处理，随后缓慢上升，第150 天时SOD 活性仍比CK2 处理低7.75%。T1 处理后木芯CAT 活性也呈先升高后降低的变化趋势，处理后第60 天时达到相对峰值，活性比CK1 和CK2 处理分别高7.40%和4.53%，随后活性逐渐下降，第120 天后趋于CK2 处理水平。如图5 所示，充气处理后木芯MDA 含量先降低后升高，第90 天时MDA含量最低，分别比CK2、CK1 处理低10.32%和12.99%，随后逐渐升高，第120～150 天MDA 含量与CK2 处理基本持平。而CK1 处理后第30～150 天CAT 活性和MDA 含量与CK2 处理均无显著差异。

图5 不同处理对POD、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影响Fig.5 Effect of different treatments on POD, SOD, CAT activity and the content of MDA

3 讨论

3.1 外源CO2 对土沉香结香的影响

3.1.1 沉香的形成及质量 传统物理造伤法诱导结香距离短、质量低、产量不确定（梅文莉等，2014），采用现代液体输入法易引发部分组织坏死，产生腐烂组织（Tanet al.，2019），形成薄片状结香（张争等，2010）。本研究中，树干填充CO2诱导7 个月后检测发现土沉香木质部纵向、横向和径向变色长度及面积逐渐增大，结香区呈块状、无明显腐烂现象，且醇溶性提取物和沉香四醇含量较高。随着诱导时间增长，土沉香结香部位次生代谢物持续积累，过渡区逐渐转化为沉香区的同时伴随新过渡区形成，这是沉香区面积不断扩大、醇溶性提取物含量始终明显高于过渡区的主要原因。由此可推测，在一定范围内增加充气次数和延长充气时间，可进一步提高结香质量、扩大结香面积，对此有待进一步验证。

3.1.2 结香时间 研究发现，采用全树输液后20 个月时2 种化学诱导沉香样品的醇溶性提取物平均含量分别为19.65%和22.13%（Zhanget al.，2012）。本研究中，树干每隔7 天填充1 次CO2、持续填充3 个月，而后诱导10 个月时沉香（结香区）的醇溶性提取物含量达21.27%。由此可见，树干填充CO2可缩短土沉香结香时间。人工诱导结香过程中胁迫处理强度往往直接影响结香时间，每隔7 天填充1 次CO2处理的结香效果明显好于每隔15 天1 次处理CO2，这说明适当提高充气频率可缩短结香时间。

本研究中，充气处理后10 个月的过渡区醇溶性提取物含量均低于7 个月，这与过渡区转化为结香区的同时新过渡区的次生代谢物积累相对滞后有关，也可能是由于过渡区的扩展速度大于结香区的沉香形成速度，从而导致次生代谢物质含量相对降低。另外因沉香中萜烯类和色酮类化合物种类丰富，各类物质的合成代谢途径差异较大，生成时间也不同（Liet al.，2021），表明沉香物质形成具有复杂性和时序性。次生代谢物的合成与积累往往决定人工诱导沉香的最终产量和质量，而树干填充CO2诱导促进沉香物质形成的时序性有待深入研究。

3.2 外源CO2 对土沉香抗逆防御反应的影响

Peng 等（2014）指出，沉香树脂在沉香体内的积累在防御系统区隔化过程中具有重要作用。树干填充CO2后，土沉香木质部导管和射线薄壁细胞内快速形成油脂和侵填体，说明CO2可激发土沉香木质部组织结构的抗性响应，这与张兴丽（2013）采用半断干法伤害诱导下土沉香射线薄壁细胞内含物变化与沉香形成有关的结果相一致。

通常，植物通过酶促和非酶促抗氧化防御系统清除活性氧（Khanet al.，2014），POD、SOD、CAT 是植物体内活性氧清除酶系统的重要组成（张星雨等，2021；Huanget al.，2020）。本研究发现，树干填充CO2可明显提升POD、CAT 活性，处理后第120 天时活性仍高于CK2 处理。SOD 是清除ROS 的第一道防线（Kar，2011；Fanet al.，2011），本研究中SOD 活性在CO2填充90 天内持续下降，可能是因为CO2持续填充诱导超氧阴离子不断迸发，导致SOD 相对过量消耗或在一定程度上抑制SOD 活性。植物细胞在逆境胁迫（如盐胁迫、干旱等）下超过其所能忍受的活性氧水平阈值，抗氧化酶活性会受到抑制（朱金方等，2015；Milleret al.，2010）。活性氧迸发可作为第二信使调控下游信号激活植物防御反应以增强抵抗外界胁迫的能力（Mittleret al.，2004），是植物抗逆防御反应启动的关键调控因素（Youet al.，2015）。持续填充CO2是否诱导活性氧不断迸发从而启动下游信号转导过程、激活防御反应，对此有待进一步研究。树干填充CO2后MDA 含量持续下降，第120～150 天与CK2 处理持平，说明土沉香体内抗氧化系统可及时清除自由基，较好维持活性氧代谢的动态平衡，避免自由基引发的脂质过氧化损伤（Gillet al.，2010；Milleret al.，2010）。CK1处理第30～150 天CAT 活性和MDA 含量与空白（CK2）无明显差异，第60 天POD 活性开始与CK2 处理基本持平，说明打孔处理引发的胁迫伤害较小，防御反应波动时间较短。

综上所述，土沉香是一种典型的伤害诱导型药用植物（Liuet al.，2013），通过比较T1 和CK1 处理下抗氧化酶活性和MDA 含量的动态变化，可知高频率树干填充CO2能够不断激发土沉香的抗逆防御反应，土沉香结香效果与防御反应持续时间正相关，然而可持续激发土沉香防御反应的物质或方法有待进一步研究。本研究结果表明树干填充CO2可显著诱导土沉香结香，但参与该结香过程的代谢通路及内在机制还需深入研究。

4 结论

1） 外源CO2可显著促进木质部射线薄壁细胞内淀粉的转化，增大导管和射线薄壁细胞内侵填体堵塞面积。

2） 外源CO2可诱导土沉香木质部变色，随诱导时间增长，树干木质部纵向、横向和径向变色长度增长，纵向变色面积增加。

3） 外源CO2可诱导土沉香形成沉香块且质地细腻，最优处理后10 个月时的醇溶性提取物含量达21.27%，沉香四醇含量达0.29%，分别是打孔对照的1.42 倍和2.11 倍。

4） 外源CO2可在短期内诱导POD、CAT 抗氧化酶活性升高，降低MDA 含量，激活土沉香树体的抗逆防御反应。